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在猪胚胎生产中,主要从屠宰场采集卵巢.由于挑选的卵母细胞来自不同生长阶段的卵泡,导致了卵母细胞质量存在差异。本研究通过亮甲酚蓝染色分选后对猪卵母细胞体外发育能力进行系统性的鉴定与研究,进一步对亮甲酚蓝筛选优质卵母细胞的方法进行验证,为保证核移植效率提供优质的卵母细胞。
本研究利用13μmol/L亮甲酚蓝(BCB)对GV期猪卵母细胞进行染色,分别检查了着色组(BCB+)、无着色组(BCB-)和对照组的卵母细胞直径、体外成熟情况、皮质颗粒迁移程度、成熟后谷胱甘肽GSH水平、乙酰荧光素FDA活力、孤雌胚胎发育能力与核移植胚胎的发育能力,为体细胞核移植提供优质的卵母细胞。在此基础上,初步研究了初次卵裂时间与孤雌胚胎发育潜能的关系。BCB染色后,对成熟卵母细胞进行孤雌激活,在激活后24 h挑选出卵裂的胚胎,将其转移到新的培养滴中继续培养,剩余未卵裂的胚胎在激活后48 h重复上述步骤,以0-48 h未分时间段的胚胎作为一组,胚胎培养144 h后,比较不同卵裂时间的胚胎发育能力,预测早期胚胎的发育潜能,为猪克隆胚胎移植提供优质的胚胎。
研究结果表明:
1)BCB染色后,猪卵母细胞直径测量与体外成熟情况:BCB+组卵母细胞直径大于BCB-组和对照组(120.47μm,104.94μm和114.81μm)。BCB+组卵母细胞成熟率为79.61%,BCB-组卵母细胞成熟率为53.51%,对照组卵母细胞成熟为63.64%,各组之间差异显著(P<0.05);染色组成熟率为66.59%,与对照组无显著差异(P>0.05)。
2)BCB染色后,猪卵母细胞皮质颗粒迁移程度、GSH水平和FDA活力检测;BCB+组卵母细胞皮质颗粒迁移完全的比例为79.79%,BCB-组为27.06%,对照组的为48.87%,各组之间差异显著(P<0.05)。BCB+组成熟卵母细胞GSH含量显著高于(P<0.05)BCB-组和对照组(10.41pmol/oocyte、5.84pmol/oocyte和6.77pmol/oocyte)。BCB+组卵母细胞FDA活力率为91.43%,BCB-组为54.32%,对照组为72.11%,各组之间差异显著(P<0.05)。BCB+卵母细胞胞质成熟完全,有利于卵母细胞的后期发育。
3)BCB染色后,猪卵母细胞的孤雌胚胎发育情况与核移植胚胎发育情况:BCB+组孤雌囊胚率为34.28%、核移植囊胚率为23.74%显著高于(P<0.05)BCB-组(12.25%,6.28%)和对照组(26.52%,17.05%),且BCB+组囊胚的细胞数最多。
4)初次卵裂时间与孤雌胚胎发育潜能的关系:BCB+组0-24h卵裂的孤雌囊胚率为44.59%,25-48h为22.86%,0-48h为35.01%,各组之间差异显著(P<0.05)。BCB-组0-24h卵裂的囊胚率为22.58%高于25-48h(8.59%)和0-48h(12.47%)。对照组0-24h卵裂的囊胚率为35.54%高于其他两个时期的囊胚率(25-48h为15.88%、0-48h为21.38%),BCB+组卵母细胞早期卵裂的孤雌胚胎的囊胚率最高。