目 的:通过对婴儿巨细胞病毒(Human Cytomegalovirus,HCMV)肝炎血浆及尿液的代谢组学检测,建立该疾病基于差异性生物标志物的湿热内蕴证、脾虚湿困证及气滞血瘀证的代谢物特征谱库。明确婴儿HCMV肝炎各证型的代谢网络变化特征,为婴儿HCMV肝炎证本质研究提供一定的客观依据。同时将HCMV导致的婴儿肝脏损伤分为无黄疸型HCMV肝炎、HCMV胆汁淤积性肝病及胆道闭锁伴HCMV感染这三种临床常见类型,通过对血浆样本的代谢组学检测,探讨HCMV造成肝脏损伤的潜在生物标志物,为这类疾病的早期诊断及治疗提供科学依据。此外通过对婴儿肝炎综合征气滞血瘀证患儿和肝外胆道闭锁气滞血瘀证患儿的尿液样本进行代谢组学检测,总结气滞血瘀证的生物标志物,寻找“异病同证”的生物学依据;同时寻找胆道闭锁的生物标志物,探索该疾病的无创诊断的可行性。方法:本研究血浆、尿液样本均来源于首都医科大学附属北京儿童医院。采用超高效液相色谱-线性离子阱/静电场轨道阱质谱联用(UHPLC-LTQ/Orbitrap-MS)技术及气相色谱质谱联用(GC-MS)技术进行血浆和尿液样本的代谢组学检测。本研究第二部分为纳入患儿的临床研究,详细列出了每一例HCMV肝炎患儿的黄疸程度及持续时间、症状体征及辨证分型。根据纳入和排除标准进行分组,并进行各组患儿的一般资料统计和实验室检查分析。本研究第三部分,共采集婴儿HCMV肝炎患儿的血浆样本115例,其中湿热内蕴证38例、脾虚湿困证36例、气滞血瘀证41例,另收集同时期正常对照组39例。采用UHPLC-LTQ/Orbitrap-MS和GC-MS的代谢组学方法检测所有血浆样本,获得各组的代谢轮廓。同时对数据进行主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)等多元统计分析,综合非参数检验及倍数变化(Fold change,FC)结果进行差异性代谢物筛选,通过LipidBlast、Mona等数据库鉴定差异性代谢物,寻找该疾病湿热内蕴证、脾虚湿困证及气滞血瘀证的潜在血浆生物标志物。本研究第四部分,共采集婴儿HCMV肝炎患儿的尿液样本122例,其中湿热内蕴证44例、脾虚湿困证35例、气滞血瘀证43例,另收集同时期正常对照组40例,均为在北京儿童医院保健中心体检的健康婴儿。同样采用UHPLC-LTQ/Orbitrap-MS和GC-MS的代谢组学方法检测所有尿液样本,获得各组的代谢轮廓。同时对数据进行PCA和OPLS-DA等多元统计分析,综合非参数检验及FC结果进行差异性代谢物筛选,并鉴定差异性代谢物,寻找该疾病湿热内蕴证、脾虚湿困证及气滞血瘀证的潜在尿液生物标志物。本研究第五部分,研究共纳入127例受试者,其中HCMV婴儿肝炎22例、HCMV胆汁淤积性肝病39例、HCMV感染伴胆道闭锁26例,正常对照组40例。采集这些受试者的血浆样本,采用GC-MS的代谢组学方法进行检测,获得各组的代谢轮廓。同时对数据进行PCA和OPLS-DA等多元统计分析,综合非参数检验及FC结果进行差异性代谢物筛选,并鉴定差异性代谢物。总结HCMV肝脏损伤涉及的代谢通路,寻找HCMV感染伴胆道闭锁的生物标志物。本研究第六部分,研究共纳入101例受试者,其中胆道闭锁患儿25例,婴儿肝炎综合征患儿38例,正常对照组婴儿38例。采集这些受试者的尿液样本,采用GC-MS的代谢组学方法进行检测,获得各组的代谢轮廓。同时对数据进行PCA和OPLS-DA等多元统计分析,综合非参数检验及FC结果进行差异性代谢物筛选,并鉴定差异性代谢物。寻找气滞血瘀证生物标志物;同时寻找胆道闭锁相关的尿液生物标志物,探索代谢组学技术用于胆道闭锁无创诊断的可行性。结 果:本研究第二部分发现气滞血瘀证组患儿黄疸程度重,持续天数长,胆汁淤积性肝病、胆道闭锁及肝硬化是该证型常见的西医肝脏损害类型。脾虚湿困证组患儿黄疸程度较轻,湿热内蕴证组患儿黄疸程度轻重不一,无黄疸型HCMV肝炎与胆汁淤积性肝病是这两个证型常见的西医肝脏损害类型。在实验室检查中,气滞血瘀证组肝脾肿大、肝硬化、胆囊充盈欠佳者较多,说明该证型肝脏损伤程度较重。本研究第三部分发现HCMV肝炎湿热内蕴证、脾虚湿困证及气滞血瘀证和正常对照组在PCA模型和OPLS-DA模型中区分明显,各证型在代谢物层面存在显著差异。三个证型组共有35个共同差异性代谢物,涉及甘油三酯、鞘磷脂、磷脂酰胆碱及溶血磷脂酰胆碱代谢紊乱,其中又以甘油三酯代谢紊乱最为显著。甘氨胆酸在气滞血瘀证组显著上调,是该证型可能的生物标志物。褪黑素在湿热内蕴证组显著上调,与该证型的炎症状态有关。本研究第四部分发现HCMV肝炎各证型组的尿液样本在PCA模型和OPLS-DA模型中均区分明显,提示各证型在尿液代谢物层面存在显著差异。各证型均涉及丙氨酸,天门冬氨酸和谷氨酸代谢、D-精氨酸与鸟氨酸代谢、组氨酸代谢、精氨酸与脯氨酸代谢紊乱。湿热内蕴证组存在D-葡萄糖、D-麦芽糖及柠檬酸等能量相关代谢物的下调;脾虚湿困证组存在氨基丙二酸、丁酸、马尿酸等与肠道菌群相关代谢物的上调或下调,涉及甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢,赖氨酸的降解及生物合成,组氨酸代谢通路的紊乱;气滞血瘀证存在氨基酸代谢通路的紊乱及乙醛酸和二羧酸代谢,柠檬酸循环等能量相关代谢通路的紊乱。本研究第五部分根据HCMV致不同类型肝脏损害的临床表现,将其分为HCMV婴儿肝炎组、HCMV胆汁淤积性肝病组及HCMV合并胆道闭锁组,并通过与正常对照组的对比,最终找到29个差异性代谢物。这些差异性代谢物涉及一系列氨基酸、脂肪酸及能量代谢紊乱。此外,我们还发现5个差异性代谢物,即氨基甲酸、谷氨酸、L-天冬氨酸、L-高丝氨酸,去甲肾上腺素均在HCMV合并胆道闭锁组上调,经ROC分析这5个代谢物构建的诊断模型可以较好区分HCMV合并胆道闭锁组和HCMV胆汁淤积性肝病组。本研究第六部分描述了胆道闭锁和婴儿肝炎综合征气滞血瘀证的尿液代谢轮廓。在OPLS-DA模型中,胆道闭锁组、婴儿肝炎综合征组和正常对照组区分明显,提示各组存在代谢组学差异。两个疾病的气滞血瘀证均涉及氨基酸及嘌呤代谢紊乱。此外经ROC分析发现α-氨基己二酸N-乙酰基-D-甘露糖胺是区分胆道闭锁和婴儿肝炎综合征潜在的生物标志物。结论:1.使用本研究所采用的UHPLC-LTQ/Orbitrap-MS和GC-MS代谢组学技术能够对HCMV肝炎湿热内蕴证、脾虚湿困证及气滞血瘀证血浆及尿液样本进行代谢轮廓分析,并能够区分和阐述各证型与正常对照组不同的代谢特征。2.根据本研究第二部分基于UHPLC-LTQ/Orbitrap-MS和GC-MS的血浆样本代谢组学检测,初步确定HCMV肝炎各证型血浆样本呈不同的代谢特征。各证型均涉及甘油三酯、鞘磷脂、磷脂酰胆碱及溶血磷脂酰胆碱代谢紊乱,以甘油三酯代谢紊乱最为显著。3.根据本研究第三部分基于UHPLC-LTQ/Orbitrap-MS和GC-MS的尿液样本代谢组学检测,初步确定HCMV肝炎各证型尿液样本呈不同的代谢特征。各证型均涉及氨基酸代谢紊乱,湿热内蕴证主要表现为能量代谢紊乱,脾虚湿困证涉及肠道菌群相关代谢物代谢紊乱,气滞血瘀证以氨基酸及能量相关代谢紊乱为主。4.根据本研究第四部分基于GC-MS的血浆样本代谢组学检测,初步确定HCMV致不同类型的肝脏损害有不同的代谢特征。HCMV造成的肝脏损害均存在氨基酸、脂肪酸及能量代谢紊乱。根据差异性代谢物构建的诊断模型可较好区分HCMV合并胆道闭锁组和HCMV胆汁淤积性肝病组。5.根据本研究第五部分基于GC-MS的尿液样本代谢组学检测,发现胆道闭锁和婴儿肝炎综合征的气滞血瘀证均涉及氨基酸及嘌呤代谢紊乱,证实了“异病同证”有其科学内涵。根据差异性代谢物构建的诊断模型可较好区分胆道闭锁和婴儿肝炎综合征。