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研究背景与目的肺癌是最常见的恶性肿瘤之一,其中80%～85%为非小细胞肺癌(None Small Cell Lung Caneer,NSCLC)。侵袭和转移是导致NSCLC治疗失败及绝大多数患者死亡的主要原因,因而寻找肺癌侵袭和转移相关基因及其分子指标成为当前迫切需要解决的问题。DAL-1(Differentially expressed in adenocarcinoma of the lung)是4.1家族成员之一,在NSCLC、乳腺癌和脑膜瘤中表达下调或缺失[1-4]。转染DAL-1至NSCLC和乳腺癌细胞株中使其重新表达,可抑制这些细胞增殖[1,5],表明DAL-1是一种肿瘤抑制基因。免疫细胞化学方法显示DAL-1蛋白定位于细胞膜的胞质侧,主要集中在细胞间的连接处,呈“honeycomb”状分布[1]。Charboneau AL等[6]研究发现DAL-1表达可以增强乳腺癌细胞之间的连接。我们前期体外实验发现,沉默DAL-1蛋白表达可使NSCLC细胞侵袭和迁移能力增强[7]。由此推测,该基因表达缺失可能削弱细胞间的连接和黏附从而导致肿瘤细胞易于发生脱落和转移。本次实验我们拟通过对人肺癌组织中DAL-1蛋白表达进行检测,并与临床病理因素进行对比分析,进一步验证DAL-1表达与NSCLC转移的关系。基因失活的机制包括基因缺失、突变等遗传学机制及DNA甲基化、染色质构象变化等表观遗传学机制。我们前期研究发现,DAL-1基因启动子甲基化是导致NSCLC细胞系和细胞株中DAL-1表达缺失的主要原因;但在部分DAL-1表达缺失的肿瘤细胞中,DAL-1基因启动子并没有出现甲基化[7],因此推测可能存在其他导致DAL-1表达缺失的原因。点突变是基因表达缺失的常见原因之一,目前研究认为DAL-1存在多个点突变位点,包括:1810 C>T/575Cys>Tyr,2166 C>T/704Thr>Thr,2146 G>T/716 Ala>Ser,2166 C>T/722Thr>Thr等,其中1810 C>T/575Cys>Tyr突变发生频率较高,且为错义突变[8-10]。因此本研究通过对人体组织DAL-1基因1810C>T/575Cys>Tyr点突变的检测,分析其与DAL-1蛋白表达的关系,进一步探讨DAL-1蛋白表达缺失的原因。方法一、免疫组化方法检测石蜡包埋的NSCLC组织167例(其中149例备有配对癌旁组织)的DAL-1蛋白表达,分析其与NSCLC临床病理因素的关系。数据采用χ2检验进行统计学分析。二、提取204例NSCLC患者配对组织标本(石蜡包埋NSCLC组织和同一患者正常淋巴结组织)及112例NSCLC患者新鲜血液标本(共316例)基因组DNA,PCR-RFLP方法检测DAL-1基因1810 C>T基因型,分析1810 C>T点突变与DAL-1蛋白表达及NSCLC转移的关系。数据采用χ2检验进行统计学分析。结果一、167例NSCLC组织中,DAL-1蛋白阳性表达97例(58.1%),阴性70例(41.9%)。其中149例NSCLC配对标本中,癌旁组织DAL-1阳性表达135例(90.6%),阴性14例(9.4%);癌组织DAL-1阳性表达87例(58.4%),阴性62例(41.6%);NSCLC癌组织DAL-1阳性表达率显著低于癌旁组织(p<0.05)。二、167例NSCLC组织中,DAL-1蛋白表达阳性率在肿瘤最大直径≤3cm组(47/66)显著高于肿瘤最大直径>3cm组(50/101()p<0.01),未发生转移组(64/78)显著高于转移组(33/89()p<0.000),Ⅰ期、Ⅱ期(67/91)显著高于Ⅲ期、Ⅳ期(30/76)(p<0.000)。其中148例腺癌和鳞癌DAL-1蛋白表达阳性率高、中分化组(63/93)显著高于低分化组(27/55)(p<0.005)。三、316例NSCLC患者DAL-1 1810 C>T基因型分布:野生型基因型TT293例(92.7%),突变型基因型23例,突变率为4.1%。其中CT20例(6.3%),CC3例(0.9%)。204例NSCLC患者正常淋巴结组织与其NSCLC组织配对资料共408个标本基因型检测结果表明:各例NSCLC肿瘤组织和相应正常淋巴结组织基因型完全一致。四、167例NSCLC组织中,发生DAL-1 1810 C>T点突变者13例。13例发生点突变患者的癌组织中DAL-1蛋白阳性表达5例,阴性8例;相应的癌旁组织DAL-1蛋白阳性表达7例,阴性5例,1例无配对癌旁组织。5例点突变患者癌组织DAL-1蛋白虽阳性表达,但均发生转移。提示DAL-1 1810 C>T点突变可能削弱DAL-1对肿瘤转移的抑制作用。五、在316例标本中,突变的23例中17例发生转移,6例未发生转移;在293例野生型的标本中,149例发生转移,144例未发生转移,NSCLC转移在DAL-1突变型与野生型组间差异有统计学意义(p<0.025)。提示DAL-1 1810 C>T点突变可能导致NSCLC更容易发生转移。六、分析经免疫组化方法检测蛋白表达的167例NSCLC组织DAL-1 1810 C>T点突变与肿瘤临床病理因素关系发现,DAL-1 1810 C>T点突变基因型分布频率在肿瘤最大直径≤3cm组(6/66)与肿瘤最大直径>3cm组(7/101),Ⅰ期、Ⅱ期组(8/91)与Ⅲ期、Ⅳ期组(5/76),组间无显著性差异(P>0.05)。DAL-1 1810 C>T点突变基因型分布频率在转移组(11/89)与无转移组(2/78)间有显著性差异(P<0.025)结论一、人NSCLC肿瘤组织存在DAL-1蛋白表达降低、缺失现象。二、NSCLC转移组的DAL-1蛋白表达阳性率显著低于未转移组,提示DAL-1蛋白表达降低、缺失可能与NSCLC转移有关。三、人NSCLC组织中DAL-1 1810 C>T突变率为4.1%。DAL-1 1810 C>T点突变不是导致DAL-1蛋白表达降低、缺失的主要原因。DAL-1 1810 C>T点突变可能与NSCLC转移有关,尚需用基因定点突变技术进一步证实。