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背景:鱼藤酮(Rotenone,Rot)是一种植物性杀虫剂,属于异黄酮家族的一员。近年来研究发现,Rot可选择性损伤中枢多巴胺(Dopamine,DA)神经系统,增加帕金森病(Parkinson’s disease,PD)的发病风险。PD是一种常见的神经退行性疾病,主要病理改变是黑质(Substantia nigra,SN)致密部DA神经元退行性变和路易氏小体(Lewy body,LB)的形成。研究表明,用Rot染毒可导致小鼠DA神经元丢失,并出现类似PD的典型临床症状,如运动迟缓、僵直、震颤等。但是,Rot损伤DA神经元,增加PD发病风险的分子机制目前尚不清楚。血脑屏障(Blood brain barrier,BBB)是大脑微血管内的一种连续的内皮膜,可以维持脑内环境的稳态。BBB的基本结构是神经血管单元(Neurovascular unit,NVU),主要由脑血管内皮细胞、周细胞、基底膜、胶质细胞以及相邻神经元等共同构成。脑内皮细胞通常通过紧密连接(Tight junctions,TJs)和粘附连接(Adherens junctions,AJs)在连接复合物处连接,主要的TJs蛋白包括ZO-1、Occludin和Claudin-5等。有研究表明,TJs的破坏可引起BBB通透性增加,从而导致突触受损和神经功能障碍,促进阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)和PD等疾病的发生。小胶质细胞是NVU的成分之一,对维持BBB的结构和功能有重要作用,但是过度激活的小胶质细胞可以损伤BBB。活化的小胶质细胞分泌的细胞毒性因子,例如活性氧(Reactive oxygen species,ROS)、白介素-1β(Interleukin-1 beta,IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)、基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinase,MMPs)和一氧化氮等都可以增加BBB的通透性。有报道证明了Rot可导致小鼠脑内发生氧化应激,促进小胶质细胞活化。但是,Rot是否可通过诱导小胶质细胞活化损伤BBB,从而诱导DA神经变性坏死目前尚未见报道。目的:因此,我们利用Rot染毒小鼠,探讨Rot对BBB通透性的影响;同时利用集落刺激因子1受体(Colony-stimulating factor 1 receptor,CSF1R)抑制剂PLX3397(Plx)去除小鼠脑内小胶质细胞和抗生素米诺环素(Minocycline,Mino)抑制小胶质细胞活化,探讨小胶质细胞激活在Rot损伤BBB以及DA神经元中的作用,明确小胶质细胞激活在Rot损伤BBB从而导致DA神经元退变中的作用。方法:1.Rot染毒模型:成年SPF级雄性C57BL/6J小鼠随机分为1个对照组和2个Rot染毒组,每组15只。Rot染毒组按剂量分为0.75 mg/kg组和1.5 mg/kg组。Rot通过腹腔注射染毒,每天一次(5 m L/kg),持续21天。Con组腹腔注射等量生理盐水(5 m L/kg)。2.Plx和Mino处理的Rot染毒模型:成年SPF级雄性C57BL/6J小鼠随机分为Con、1.5 mg/kg Rot、1.5 mg/kg Rot+Plx和1.5 mg/kg Rot+Mino四组,每组15只。Rot染毒方法同上。1.5 mg/kg Rot+Plx组小鼠在Rot染毒前一周给予40 mg/kg Plx,每天灌胃一次,7天后每隔一天灌胃一次(Rot染毒前30分钟)。1.5 mg/kg Rot+Mino组给予50 mg/kg Mino,每隔一天腹腔注射一次(Rot染毒前30分钟)。Con组小鼠给予等量生理盐水(5 m L/kg)。3.BBB通透性检测:伊文思蓝(Evans Blue,EB)进入血液循环后可迅速与血清白蛋白结合形成大分子复合物,免疫球蛋白G(Immunoglobulin G,Ig G)是血清主要的抗体成分,这两种物质都不能通过BBB。因此,我们通过EB渗透实验和Ig G免疫组化染色检测小鼠BBB通透性变化。Western blot、免疫荧光染色和q RT-PCR检测小鼠中脑TJs(ZO-1、Occludin和Claudin-5)蛋白表达和m RNA水平变化。4.小胶质细胞活化水平及炎性因子检测:使用Iba-1抗体通过免疫组化染色检测小鼠黑质区小胶质细胞的活化水平。Western blot检测小鼠中脑诱导型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase,i NOS)和精氨酸酶-1(Arginase-1,Arg-1)表达水平的变化,q RT-PCR检测小鼠中脑i NOS、TNF-α和IL-1βm RNA的变化。5.MMP-2和MMP-9表达、活化及m RNA水平检测:Western blot检测小鼠脑内MMP-2 pro、MMP-2 active、MMP-9 pro和MMP-9 active表达水平改变,q RT-PCR检测MMP-2和MMP-9 m RNA的变化。6.DA神经元损伤以及步态改变检测:使用酪氨酸羟化酶(Tyrosine hydroxylase,TH)抗体通过免疫组化染色检测小鼠黑质和纹状体DA神经元的损伤情况。通过步态实验检测小鼠运动功能的变化。结果:1.Rot对小鼠中脑BBB通透性的影响:EB实验结果显示,与Con组相比,0.75 mg/kg和1.5 mg/kg Rot组小鼠大脑颜色变蓝,中脑EB含量增多,其中1.5mg/kg Rot组增加明显,差异具有统计学意义(P<0.01)。Ig G染色结果显示,1.5 mg/kg Rot组小鼠黑质区Ig G染色光密度明显高于Con组,差异具有统计学意义(P<0.01),提示BBB通透性增加。2.Rot对小鼠中脑TJs蛋白的影响:Western blot结果显示,与Con组相比,0.75 mg/kg和1.5 mg/kg Rot组小鼠中脑ZO-1、Occludin和Claudin-5含量均有所降低,其中1.5 mg/kg组降低较明显,差异具有显著性(P<0.05)。免疫荧光染色与Western blot检测结果一致,与Con组相比,1.5 mg/kg Rot明显降低了小鼠中脑ZO-1、Occludin和Claudin-5的蛋白表达水平。3.Rot对小鼠中脑小胶质细胞活化的影响:免疫组化结果显示,与Con组相比,0.75 mg/kg和1.5 mg/kg Rot组小鼠黑质区的小胶质活化水平增加、胞体增大、Iba-1染色光密度升高,其中1.5 mg/kg Rot组的升高较显著,差异具有统计学意义(P<0.05)。4.Plx和Mino对小鼠中脑小胶质细胞数量和活化的影响:免疫组化染色显示,与Con组相比,1.5 mg/kg Rot组小鼠黑质区的小胶质细胞活化水平增加,Iba-1染色光密度升高,Mino处理明显减轻了1.5 mg/kg Rot诱导的小胶质细胞活化,Iba-1染色光密度显著降低(P<0.05);Iba-1+小胶质细胞计数结果显示,Plx组小鼠大脑黑质区小胶质细胞数量显著下降,与Con组相比减少了89.3%,差异有统计学意义(P<0.01)。5.Plx和Mino对Rot诱导小鼠中脑BBB损伤的影响:BBB通透性检测结果显示,与Con组相比,1.5 mg/kg Rot组小鼠中脑EB含量增多,Ig G染色光密度显著增加;Plx和Mino处理明显降低了1.5 mg/kg Rot诱导的EB含量增多和Ig G染色光密度增加,与1.5 mg/kg Rot组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。Western blot和q RT-PCR结果显示,与Con组相比,1.5 mg/kg Rot组小鼠中脑ZO-1、Occludin和Claudin-5三种TJs蛋白表达和m RNA水平均显著降低(P<0.05);Plx和Mino处理显著减轻了1.5 mg/kg Rot诱导的TJs蛋白表达和m RNA水平下降,与1.5 mg/kg Rot组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。6.Plx和Mino对Rot诱导小鼠中脑细胞毒性因子表达与m RNA水平的影响:Western blot结果显示,与Con组相比,1.5 mg/kg Rot组小鼠中脑i NOS含量显著升高,Arg-1含量显著降低(P<0.05);Plx和Mino处理明显降低了1.5 mg/kg Rot诱导的i NOS升高,并增加了Arg-1含量,与1.5 mg/kg Rot组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。与Con组相比,1.5 mg/kg Rot组小鼠中脑MMP-9 pro、MMP-9active、MMP-2 pro和MMP-2 active的含量显著升高(P<0.05);Plx和Mino处理后明显降低了1.5 mg/kg Rot诱导的MMP-9和MMP-2含量增多和活性增加,与1.5mg/kg Rot组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。q RT-PCR结果显示,与Con组相比,1.5 mg/kg Rot组小鼠中脑TNF-α、i NOS、IL-1β以及MMP-2和MMP-9的m RNA含量明显增加(P<0.05);Plx和Mino处理明显减轻了1.5 mg/kg Rot诱导的炎症因子、MMP-2和MMP-9的m RNA含量增加,与1.5 mg/kg Rot组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。7.Plx和Mino对Rot诱导小鼠DA神经元数量下降和步态异常的影响:免疫组化结果显示,与Con组相比,1.5 mg/kg Rot组黑质区TH+DA神经元数量显著下降,DA神经元突触显著减少(P<0.01);Plx和Mino处理明显缓解了1.5 mg/kg Rot诱导的DA神经元损伤,与1.5 mg/kg Rot组相比,差异具有统计学意义(P<0.01)。步态检测结果显示,与Con组相比,1.5 mg/kg Rot组小鼠四肢步幅明显减少,前肢间距和后肢间距明显增加(P<0.05);Plx和Mino处理明显减轻了1.5 mg/kg Rot诱导的小鼠步态异常,与1.5 mg/kg Rot组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:1.Rot暴露增加了小鼠中脑BBB通透性,降低了TJs蛋白表达水平。2.小胶质细胞活化及炎症因子释放是Rot诱导小鼠BBB损伤的重要因素。3.小胶质细胞激活介导的BBB损伤参与了Rot诱导的小鼠DA神经退变和行为异常。