狂犬病街毒是一种嗜神经性,能引起几乎所有哺乳动物发生脑神经炎和100%致死性的病毒。其属于弹状病毒科,狂犬病病毒属,基因组为单股负链RNA病毒。基因组长约12kb,负责编码5种结构蛋白：核蛋白、磷蛋白、基质蛋白、糖蛋白和大转录蛋白。核蛋白、磷蛋白、大转录蛋白和病毒的基因组构成核蛋白体复合物(RNP),仅有它才能启动病毒复制和蛋白表达。我国是狂犬病发病最为严重的地区之一,近些年发病人数逐年增加,每年的发病人数都在3000～4000之间。数据显示,人狂犬病例中93%都是由犬咬伤发病的,因此,犬的免疫预防成为对于预防人的狂犬病是非常重要的。为获得活的病毒载体疫苗和便利的病毒检测方法。选用了有很好免疫原性,在我国广泛用于制备人狂犬病灭火苗、制备动物弱毒苗和灭活苗的Flury-LEP疫苗株,用于建立反向遗传学系统。在此基础上,表达绿色荧光蛋白的重组LEP-EGFP病毒被拯救,并进行了分析。本研究为研制以Flury-LEP株病毒活载体多价疫苗、高效安全的基因修饰疫苗奠定了基础,同时为检测病毒中和抗体提供了更为方便和经济新方法。1.为获得狂犬病病毒载体,在建立Flury-LEP疫苗株反向遗传学基础之上,通过已知序列设计引物,经SOE-PCR在Flury-LEP cDNA4096nt处突变出Pme Ⅰ酶切位点。选用EGFP为报告基因,利用PCR引物设计技术在此ORF两端引入本疫苗株L蛋白转录开始和终止序列,以及Pme Ⅰ位点,将此报告基因克隆入病毒cDNA Pme Ⅰ位点处构建了表达绿色荧光蛋白(GFP)的重组LEP基因组cDNA克隆pCI-LEP-EGFP。将PCI-LEP-EGFP和辅助质粒PCAGG-N、PCAGG-P、PCAGG-L共转染293T细胞,荧光显示成功拯救重组病毒LEP-EGFP.2.为获得狂犬病病毒LEP-EGFP作为载体的生物学特性。LEP-EGFP和野生型LEP (wtLEP)以M.O.I.为0.01分别感染NA细胞和BHK-21细胞,在24h、72h和120h取样滴定,生长动力学特性与亲本株无明显差异。wtLEP和LEP-EGFP分别颅内接种Balb/c雌性小鼠,Reed-Muench法计算LDso分别为6.3个FFU和8.8个FFU,两毒株小鼠的致病性没有显着差异。LEP-EGFP在BHK-21细胞中连续传代9次,各代保持EGFP的稳定表达及生物学特性不变。3.为鉴定EGFP表达是否影响Flury-LEP活疫苗载体免疫原性,和开发更为方便、快捷中和抗体检测方法。wtLEP和LEP-EGFP分别以股内侧免疫7周龄Balb/c,三周后采血,所获得的抗体滴度显示了很好的一致性(P>0.05)。比格犬免疫Flury-LEP弱毒苗或灭活苗三周后获得血清,经IFAT (Indirect fluorescent antibody test)和LEP-EGFP直接荧光下检测中和50%攻击毒株抗体滴度,两种方法检测的中和抗体滴度显示很好的相似性(P>0.05)。本研究获得了重组LEP-EGFP疫苗载体,其在致病性、免疫原性和生长动力学与其母本相似。其用于中和抗体检测,结果与IFAT方法有很好的相似性。本研究将为狂犬病病毒载体活疫苗和中和抗体检测发挥重要作用。