论文部分内容阅读
紫外分光光度法的显色专属性较差，易受环境、仪器等外部因素影响，所以建立专属性强的高效液相色谱法来测定合欢皮中的总皂苷是很有意义的。利用建立的合欢皮总皂苷HPLC检测法，通过四因素三水平的正交试验，选择一条总皂苷得率最高的工艺路线。由于合欢皮中含有的成分复杂，本文旨在分离得到活性较高并且成分较为简单的几种组分，同时将其中的几个峰标定为指纹图谱峰，为合欢皮中总皂苷的含量测定提供一个有效的质量标准。本课题建立合欢皮抗新生血管有效部位总皂苷的HPLC定量分析方法，为控制合欢皮有效成分的含量提供参考。合欢皮总皂苷多以齐墩果酸为母核，通过酸水解将皂苷水解成苷元，即齐墩果酸。故以齐墩果酸为标准品，建立HPLC测定方法；采用单因素和正交试验，分别考察酸的种类和酸的用量、酸的浓度、反应时间、反应温度因素对水解程度的影响，确定最佳的水解条件；并与紫外分光光度法相比较，进行专属性考察。最佳水解总皂苷的酸为硫酸；影响酸水解程度的因素为：反应时间>酸用量>酸浓度>反应温度；其最佳水解工艺为：硫酸浓度3mol/L，料液比1:150，水解温度85℃，水解时间4h。与传统的紫外分光光度法相比较，该方法分析齐墩果酸含量的准确度良好、灵敏度较高、专属性较强。根据建立的总皂苷定量分析方法，利用四因素三水平的正交试验，筛选一条提取效率最高的工艺路线，得到组分1-组分9这九个组分，分别考察乙醇浓度、回流时间、提取次数、萃取次数4个因素。影响提取的因素依次为：萃取次数>提取次数>回流时间>乙醇浓度，所得最佳的提取工艺路线为70%的乙醇水溶液，提取2次，每次回流提取3h，水饱和正丁醇萃取4次。以水饱和正丁醇相为原料，利用固相萃取技术（SPE）分离得到组分A和组分B，将两个组分以HMEC-1细胞进行活性筛选，结果为组分B的IC50为1.93±0.07μg/mL，平行分离三批正丁醇相样品，组分B的平均得率为52.6%，符合中药五类药的申报要求，即活性组分含量大于50%；以组分B为原料，利用制备色谱分离技术将其分成五个部分，得到组分B-1、组分B-2、组分B-3、组分B-4和组分B-5，将这五个组分以HMEC-1进行活性评价，结果为组分B-4的IC50为1.449±0.11μg/mL。最后，本论文以活性最好组分B-4为原料，对组分B-4进行HPLC分析，结果显示其中有3个分离度最好、峰面积最大，在合欢皮指纹图谱研究中可标定为指纹图谱峰，这三个色谱峰分别对应了整个色谱图中的14、21、22号峰，所以将14、21、22号峰标定为指纹图谱特征峰，并且对这三个特征性指纹峰做了峰面积的初定，所得结果：14号峰的峰面积不小于25.7mAU*min，21号峰的峰面积不小于55.89mAU*min，22号峰的峰面积不小于23.79mAU*min。