论文部分内容阅读
目的：通过体外分离培养鉴定第3代骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenc hymal stem cells，BMSCs)，移植于APP/PS1小鼠侧脑室，用补脑Ⅰ号进行干预，从血管神经再生角度探讨补脑Ⅰ号对APP/PS1小鼠脑内BMSCs移植分化的影响，运用中西医理论分析其可能机制。
方法：7-8周大C57BL/6小鼠分离培养获得BMSCs，传至第3代后经流式细胞仪检测BMSCs表面标记物CD34、CD44、CD45、CD90.2的表达情况，BrdU标记第3代BMSCs用于细胞移植，实验分为5组：正常组(C57BL/6小鼠)、模型组(APP/PS1小鼠)、BMSCs组、补脑Ⅰ号组、补脑Ⅰ号+BMSCs组：在小鼠脑立体定位仪下将BrdU标记的第3代BMSCs移植入BMSCs组、补脑Ⅰ号+BMSCs组APP/PS1小鼠侧脑室内，予补脑Ⅰ号方灌胃4周后，用免疫荧光双标检测Nestin、NF200、GFAP以观察BMSCs移植分化情况，免疫组化检测VEGF、bFGF、BDNF、NGF的表达情况，实时荧光定量(Quantitative real-time Polymerase Chain Reaction，QPCR)检测VEGF、bFGF、BDNF相对基因表达量，Western Blotting(WB)检测VEGF、BDNF蛋白表达情况，观察移植后的BMSCs在小鼠脑内存活、分化情况。
结果：1.流式细胞仪检测BMSCs结果显示：CD44、CD90.2呈阳性，阳性率分别为99.98％、96.16％，CD34、CD45呈阴性，阴性率分别为90.60％、94.88％，获得纯度较高活性较好的第3代BMSCs。
2.免疫荧光双标显示，DAPI蓝色标记为细胞核，红光为BrdU标记的第3代BMSCs，标记在细胞核上：绿光为标记的GFAP、NF200、Nestin，标记在细胞膜上。在BMSCs组海马CA1区可见少量BrdU标记的第3代BMSCs及GFAP、NF200表达，补脑Ⅰ号+BMSCs组海马CA1区、双侧DG区可见BrdU标记的第3代BMSCs、GFAP、NF200表达。BMSCs组、补脑Ⅰ号+BMSCs组CA1区、双侧DG区Nestin有少量表达。
3.采用ImageJ软件对各组小鼠海马区免疫组化NGF、BDNF、VEGF、bFGF表达进行统计，结果显示：BMSCs组、补脑Ⅰ号组、BMSCs+补脑Ⅰ号组NGF、BDNF、bFGF表达呈弱阳性;BMSCs组、补脑Ⅰ号组VEGF表达呈弱阳性，而BMSCs+补脑Ⅰ号组表达呈阳性。
4.QPCR结果显示：与正常组比较，模型组BDNF、VEGF及bFGFmRNA相对表达量明显下调，具有极显著性差异(P＜0.01);与模型组比较，BMSCs组、补脑Ⅰ号组、BMSCs+补脑Ⅰ号组BDNF、VEGF及bFGFmRNA相对表达量均明显上调，有极显著性差异(P＜0.01);与补脑Ⅰ号组、BMSCs组比较，BMSCs+补脑Ⅰ号组BDNF、VEGF及bFGFmRNA相对表达量均明显上调，具有极显著性差异(P＜0.01)。说明BMSCs、补脑Ⅰ号均能促进AD小鼠血管神经再生，而BMSCs+补脑Ⅰ号联合应用能显著上调BDNF、VEGF及bFGFmRNA相对表达量，促进血管神经再生的能力更强。
5.WB结果显示：与正常组比较，模型组BDNF、VEGF蛋白表达显著性降低(P＜0.01);与模型组比较，BMSCs+补脑Ⅰ号组BDNF蛋白、BMSCs组VEGF蛋白表达均有不同程度上升，具有统计学意义(P＜0.05)，而补脑Ⅰ号、BMSCs+补脑Ⅰ号组VEGF蛋白表达明显上升具有极显著性差异(P＜0.01);与BMSCs组、补脑Ⅰ号组比较，BMSCs+补脑Ⅰ号组VEGF蛋白表达均上升，具有显著性差异(P＜0.05)。说明补脑Ⅰ号、BMSCs组均能促进AD小鼠的血管再生，而BMSCs+补脑Ⅰ号组促进血管神经再生的能力更强。
结论：1.运用全骨髓贴壁法可获得纯度较高活性较好的第3代BMSCs;
2.BMSCs在脑内移植后可以存活、迁移、分化为神经细胞、神经胶质细胞，可在一定程度上促进损伤血管及神经的功能恢复;3.单独的补脑Ⅰ号组及BMSCs组有促进血管神经再生能力，但补脑Ⅰ号联合BMSCs移植可增强BMSCs在脑内的存活、迁移、分化为神经细胞及神经胶质细胞，且促进血管神经再生能力更强;4.在AD发病前期及早期使用补脑Ⅰ号、BMSCs进行血管神经功能保护，可能是阻止AD发生、发展的有效途径。
方法：7-8周大C57BL/6小鼠分离培养获得BMSCs，传至第3代后经流式细胞仪检测BMSCs表面标记物CD34、CD44、CD45、CD90.2的表达情况，BrdU标记第3代BMSCs用于细胞移植，实验分为5组：正常组(C57BL/6小鼠)、模型组(APP/PS1小鼠)、BMSCs组、补脑Ⅰ号组、补脑Ⅰ号+BMSCs组：在小鼠脑立体定位仪下将BrdU标记的第3代BMSCs移植入BMSCs组、补脑Ⅰ号+BMSCs组APP/PS1小鼠侧脑室内，予补脑Ⅰ号方灌胃4周后，用免疫荧光双标检测Nestin、NF200、GFAP以观察BMSCs移植分化情况，免疫组化检测VEGF、bFGF、BDNF、NGF的表达情况，实时荧光定量(Quantitative real-time Polymerase Chain Reaction，QPCR)检测VEGF、bFGF、BDNF相对基因表达量，Western Blotting(WB)检测VEGF、BDNF蛋白表达情况，观察移植后的BMSCs在小鼠脑内存活、分化情况。
结果：1.流式细胞仪检测BMSCs结果显示：CD44、CD90.2呈阳性，阳性率分别为99.98％、96.16％，CD34、CD45呈阴性，阴性率分别为90.60％、94.88％，获得纯度较高活性较好的第3代BMSCs。
2.免疫荧光双标显示，DAPI蓝色标记为细胞核，红光为BrdU标记的第3代BMSCs，标记在细胞核上：绿光为标记的GFAP、NF200、Nestin，标记在细胞膜上。在BMSCs组海马CA1区可见少量BrdU标记的第3代BMSCs及GFAP、NF200表达，补脑Ⅰ号+BMSCs组海马CA1区、双侧DG区可见BrdU标记的第3代BMSCs、GFAP、NF200表达。BMSCs组、补脑Ⅰ号+BMSCs组CA1区、双侧DG区Nestin有少量表达。
3.采用ImageJ软件对各组小鼠海马区免疫组化NGF、BDNF、VEGF、bFGF表达进行统计，结果显示：BMSCs组、补脑Ⅰ号组、BMSCs+补脑Ⅰ号组NGF、BDNF、bFGF表达呈弱阳性;BMSCs组、补脑Ⅰ号组VEGF表达呈弱阳性，而BMSCs+补脑Ⅰ号组表达呈阳性。
4.QPCR结果显示：与正常组比较，模型组BDNF、VEGF及bFGFmRNA相对表达量明显下调，具有极显著性差异(P＜0.01);与模型组比较，BMSCs组、补脑Ⅰ号组、BMSCs+补脑Ⅰ号组BDNF、VEGF及bFGFmRNA相对表达量均明显上调，有极显著性差异(P＜0.01);与补脑Ⅰ号组、BMSCs组比较，BMSCs+补脑Ⅰ号组BDNF、VEGF及bFGFmRNA相对表达量均明显上调，具有极显著性差异(P＜0.01)。说明BMSCs、补脑Ⅰ号均能促进AD小鼠血管神经再生，而BMSCs+补脑Ⅰ号联合应用能显著上调BDNF、VEGF及bFGFmRNA相对表达量，促进血管神经再生的能力更强。
5.WB结果显示：与正常组比较，模型组BDNF、VEGF蛋白表达显著性降低(P＜0.01);与模型组比较，BMSCs+补脑Ⅰ号组BDNF蛋白、BMSCs组VEGF蛋白表达均有不同程度上升，具有统计学意义(P＜0.05)，而补脑Ⅰ号、BMSCs+补脑Ⅰ号组VEGF蛋白表达明显上升具有极显著性差异(P＜0.01);与BMSCs组、补脑Ⅰ号组比较，BMSCs+补脑Ⅰ号组VEGF蛋白表达均上升，具有显著性差异(P＜0.05)。说明补脑Ⅰ号、BMSCs组均能促进AD小鼠的血管再生，而BMSCs+补脑Ⅰ号组促进血管神经再生的能力更强。
结论：1.运用全骨髓贴壁法可获得纯度较高活性较好的第3代BMSCs;
2.BMSCs在脑内移植后可以存活、迁移、分化为神经细胞、神经胶质细胞，可在一定程度上促进损伤血管及神经的功能恢复;3.单独的补脑Ⅰ号组及BMSCs组有促进血管神经再生能力，但补脑Ⅰ号联合BMSCs移植可增强BMSCs在脑内的存活、迁移、分化为神经细胞及神经胶质细胞，且促进血管神经再生能力更强;4.在AD发病前期及早期使用补脑Ⅰ号、BMSCs进行血管神经功能保护，可能是阻止AD发生、发展的有效途径。