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在免疫学界，免疫耐受一直是研究的重点和难点。失能是机体维持外周免疫耐受的一个主要机制。近年来T细胞失能机制的研究已成为免疫学研究的一个热点。 超抗原是一类新型的抗原分子，它以TCRVβ特异性的方式直接激活大量T细胞。其激活T细胞的独特方式，决定了超抗原具有重要的生物学效应。其中，引起T细胞克隆失能和删除便是其重要生物学影响之一。 为探讨T细胞失能的分子机制，几个研究组进行了一些研究。研究结果表明：失能T细胞中，IL-2基因转录受到伤害是由于TCR活化诱导的p21Ras及其下游MAPK途径受阻所致，即所谓的“Ras-blocked”失能。另外还涉及到转录因子AP-1、NF-κB、NF-AT、c-Fos、FosB、JunB，负性调节因子和RaP1。最近，有研究者在体内诱导的T细胞失能中，发现失能是通过选择性地损害TCR活化诱导的Ca/calcineurin途径来诱导和维持的。少量钙离子载体的加入就能恢复此失能状态，说明这是一种有别于上述失能的“Calcium-blocked”失能。然而，这仅仅是T细胞活化信号的中下游事件。造成这些TCR信号下游受阻事件的上游事件是什么？作为对T细胞活化起关键作用的共刺激分子，CD28/CTLA-4在超抗原诱导的T细胞失能中分别扮演何种角色呢？人们对T细胞失能的胞内生化基础很不清楚。这些问题的阐明对探讨免疫耐受本质的起着关键作用。 超抗原与T细胞相互作用的MHCⅡ类分子非限制性以及大量活化T细胞的特性，使体外失能模型的建立成为可能。本课题通过在体外，用超抗原SEA诱导人外周血T细胞的失能，从而首次建立了超抗原诱导T细胞失能的体外模型，并首次对超抗原诱导的人外周血T细胞失能分子机制进行了研究。实验内容及结果主要包括以下几个方面： 1．超抗原SEA对外周血了细胞的活化特点 初始T细胞接触超抗原后会产生强烈的增殖反应，对抗原的再次刺激，T细胞表现出无反应性。也就是说免疫耐受是T细胞被超抗原活化的后续过程。对超抗原活化T细胞的特点进行了解是研究免疫耐受的前提。 SEA是一种葡萄球菌分泌的外毒素，也是研究最清楚的一种超抗原。我们用超抗原SEA刺激从外周血分离出的PBMC，全面系统地研究了SEA对人外周血 T细胞的活化特点：①采用 3H1dR掺入法实验发现 SEA活化T细胞的最佳浓度范围为 10上0‘＂g／mL。②双抗体夹心 ELISA ＄表明 SEA对T细胞的活化作用在第二、3天达高峰。③通过FACS分析SEA初次刺激和再次刺激的T细胞CD4和CDS表型，发现T细胞不管是初次或再次接触SEA，SEA对CD4“和CDS“T细胞两亚群起同等程度的活化作用，而不改变CD4／CDS表型。 2．建立超抗原SEA诱导了细胞失能的体外模型 研究T细胞失能机制的前提是建立一合适的失能模型。为此，我们做了以下工作：①短期静息SEA反应性T细胞系的建立。首先加入超抗原SEA活化PBMC，72h后，去除SEA，力入rhIL－二（100U／！nL），以扩增SEA反应性T细胞，去除未反应性的细胞。经过两周以上的维持，可得到高纯度的静息SEA反应性T细胞。②证明经过处理后的PBMC可作为超抗原SEA 的抗原提呈细胞。将新鲜分离出的PBMC 经Y．射线照射或用MitoffiyCillC处理后，其增殖能力受到抑制，但保留了其提呈抗原作用。用这种方法处理过的细胞可成功地提呈SEA到T细胞，使T细胞活化。③通过HyPaqueIicoll密度梯度离心法可成功地将经SEA多次刺激过的SEA反应性T细胞与非反应性细胞分离开来，FACS分析所得到的细胞95％以上为SEA反应性T细胞。④证明了在体外经SEA多次刺激过的T细胞处于一无反应状态：将静息短期SEA反应性T细胞与经SEA多次刺激过的T细胞接种培养板，用经上述方法处理过的PBMC作抗原提呈细胞，加 x 入SEA，置于CO。孵箱中培养72h。’H1dR掺入法检测各孔细胞的增殖。 ELISA检测各孔细胞培养48h上清的IL－2浓度。结果表明经SEA多次刺 激过的T细胞处于失能状态，受SEA的再次刺激时，不能增殖，IL上产 生缺乏。从而首次建立了超抗原诱导T细胞失能的体外模型。 3．超抗原SEA诱导丁叁胞失能白分子机未 ①超抗原 SEA诱导的失能 T细胞，IL－ZR a链表达正常，外源性 IL，2 的加入可逆转其失能状态。PMA单独作用能部分恢复T细胞的增殖，但 ＊＊A与1加＊＊yeh的复合作用则更大程度地使T细胞的失能状态得到恢 复。从而首次发现失能T细胞之所以不能增殖，是由于T细胞活化诱导的 信号转导到胞核的Ras／MAPK途径和 Ca／calcineurin途径受阻，从而使IL上 基因不能正常转录。②失能T细胞中，对IL上基因转录起重要作用的转录 因子AP八转录活性减弱，且组份缺陷，这与失能T细胞中IL－2产生缺乏 或减少有关；NF上appaB的转录活性却强于活化组T细胞。其在夫能诱导 和维持中的作用有待进一步探讨。③超抗原SEA诱导的