日本血吸虫病在我国仍然是重要的公共卫生问题之一。虽然经过长期的不懈努力,血吸虫病疫情逐年下降,然而,长期的血吸虫病防治实践表明,一些慢性血吸虫病患者在经杀虫消除血吸虫病原后,业已存在的肝脏炎症环境仍有进一步恶化的可能,表现为肝纤维化的持续加重乃至发展到晚期血吸虫病阶段。这一问题的实质是,当前对血吸虫病慢性化的致病机制,还缺乏深入的认识并尚未引起足够的重视。慢性血吸虫病以肝纤维化为主要致病基础,肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)活化起关键作用,但肝星状细胞持续活化的诱导因子、细胞信号通路等详细机制,尚未明了,而临床缺乏抗血吸虫病肝纤维化药物治疗的有效作用靶点,使之成为制约防治工作质量的因素。研究表明,血吸虫感染早期所形成的炎性微环境对虫卵肉芽肿的形成起至关重要的作用。我们前期的研究结果也发现,血吸虫感染的炎症应答不仅介导了感染急性期虫卵肉芽肿的形成,还启动了纤维化相关细胞的活化和基因的表达。因此,深入研究血吸虫感染所致的肝纤维化过程中HSCs的持续活化因素,有助于揭示血吸虫病慢性化的致病机制,同时也是寻找血吸虫病有效药物靶点迫切需要的环节。大量研究表明,炎症反应是各种纤维化疾病发生的重要启动因素,各种促炎因子的释放所致肝脏炎症微环境在纤维化的发生发展中起到至关重要的作用。固有免疫作为机体第一道防御屏障,其通过模式识别受体(pattern recognition receptor,PRR)识别病原体以及机体受损细胞释放的有害物质进而激活下游信号通路,引起抗感染炎症反应,在保护自身的同时,也造成组织损伤。其中NLRP3炎症小体是近年来研究较为广泛的一种模式识别受体,其活化后能够激活caspase-1酶,剪切加工并促进促炎细胞因子IL-1β、IL-18的成熟和分泌以及引起细胞焦亡。IL-1β能直接刺激成纤维细胞分泌胶原并且是调控MMP9、MMP13、TIMP等纤维化相关因子表达的关键因素。有研究表明,在感染或细胞损伤局部非免疫细胞炎症小体的活化先于免疫细胞。由此,我们推测,在日本血吸虫感染过程中,不同病期(早期、急性期、慢性期)HSCs内可能存在NLRP3炎症小体信号通路的活化。本研究从信号通路活化HSCs入手,动态分析感染过程中NLRP3炎症小体信号通路的活化情况及可能发挥的调控作用。在血吸虫病肝脏虫卵肉芽肿及纤维化病理过程中,可溶性虫卵抗原(soluble egg antigen,SEA)持续的激活免疫应答被认为是血吸虫性肝纤维化形成的关键因素。除了虫源性因素SEA起到的重要作用外,作为炎症诱导因素的活性氧,是机体遭受体内、外各种有害因素刺激时氧化应激反应的产物。目前认为,所有NLRP3激活剂均能诱导产生活性氧,故活性氧与NLRP3炎症小体的活化之间关系密切。鉴于血吸虫病肝纤维化发生、发展中的关键因素是HSCs活化,而NLRP3炎症小体信号通路的活化与纤维化病变有着紧密关系,因此,本研究建立日本血吸虫感染早期、急性期和慢性期小鼠模型,观察在感染过程中HSCs内是否存在NLRP3炎症小体信号通路活化现象并分析其活化规律。在此基础上,我们着眼于外源性病原体相关分子模式SEA以及内源性损伤相关分子模式活性氧,观察它们在HSCs NLRP3炎症小体形成与活化中的作用以及对其之间的关系进行分析。以上研究有助于我们认识NLRP3炎症小体在日本血吸虫感染过程HSCs活化中的作用,为深入阐明血吸虫病肝纤维化的致病机制打下基础,并为治疗血吸虫病肝纤维化药物研发,提供可资参考的靶点。为此,本文进行了以下几个方面的研究。一、日本血吸虫病小鼠HSCs表达NLRP3炎症小体的研究我们利用免疫组化技术分析了感染日本血吸虫不同阶段小鼠肝脏内IL-1β、NLRP3以及Caspase-1酶的表达情况,并进一步分离了感染不同阶段HSCs,检测了NLRP3炎症小体信号通路相关分子的表达变化。结果显示,在组织水平,IL1-β在感染第3周其转录水平开始升高,在感染第6周及12周均明显持续高表达;NLRP3和Caspase-1在感染第6周明显升高并随感染进程呈持续高表达状态。提示我们,IL-1β参与了感染早期肝脏炎性免疫微环境的形成;而在血吸虫感染所致肝脏病变中,肝脏炎症及纤维化程度逐渐加重,NLRP3/Caspase-1/IL-1β信号通路随感染的进程呈持续活化状态。初步说明NLRP3炎症小体活化参与了日本血吸虫所致肝脏炎症及纤维化病变过程。为明确HSCs中NLRP3炎症小体信号通路的存在及其对HSCs活化的影响,我们利用人HSCs细胞系LX-2,实验证明HSCs能够表达NLRP3炎症小体。而体内实验结果显示,在感染早期小鼠HSCs活化的指标α-SMA以及NLRP3/IL-1β的表达开始升高,并在感染急性期及慢性期阶段呈持续高表达。以上结果表明,在血吸虫还未产卵的感染早期阶段,HSCs便开始出现活化现象。NLRP3炎症小体作为固有免疫系统的重要组成部分,其信号通路相关分子伴随着感染的进程而处于持续高表达状态。结果提示,伴随着HSCs的活化过程,NLRP3炎症小体在HSCs内的形成和活化,可能是血吸虫肝病纤维化发生发展中起重要作用的机制或环节之一。二、外源性因素在血吸虫肝病HSCs中NLPR3炎症小体形成和活化中的作用血吸虫SEA是血吸虫感染引起肝脏致病的主要虫源性因素。本研究发现,在SEA刺激作用下,代表NLRP3炎症小体形成的NLRP3蛋白与ASC蛋白的结合能力显著增强;而其下游caspase-1活性以及IL-1β的分泌同样升高。同时,我们也发现,SEA能够促发由NLRP3炎症小体活化而引发的细胞焦亡。细胞焦亡的发生不仅是炎症小体活化的重要特征,其引发的细胞受损进而释放大量有害物质也可能是血吸虫病肝脏炎症纤维化持续存在发展的重要因素。我们的结果表明,HSCs内NLRP3炎症小体能够被虫源性因素SEA所激活并发挥重要的生物学效应,提示我们在血吸虫感染肝脏致病中,虫卵在沉积肝脏时所释放的SEA可能是HSCs中NLRP3炎症小体形成与活化的重要外源性因素之一。三、氧化应激在血吸虫肝病HSCsNLRP3炎症小体形成和活化中的作用有研究表明,肝纤维化过程中伴有活性氧的大量生成,而过量的活性氧促进炎症及纤维化反应。在NLRP3炎症小体活化机制的相关研究中发现,活性氧可能为各种因素导致NLRP3炎症小体激活的汇聚点,在激活NLRP3炎症小体中发挥着核心作用。我们分离了血吸虫感染不同阶段小鼠的肝脏组织及血清,检测了反应机体氧化应激反应的主要指标,结果显示,超氧化物歧化酶SOD、还原型谷胱甘肽GSH以及过氧化氢酶CAT在感染第6周小鼠肝脏组织中表达明显下降,至感染12周其活性持续处于低表达状态;而过氧化终产物丙二醛MDA的含量在感染第6周时明显升高并持续高表达至感染12周。同时我们也采用免疫荧光技术检测肝脏组织中活性氧水平的变化,结果发现,感染3周时肝脏内的活性氧表达水平便已开始升高,感染6周及12周呈明显高表达状态。以上结果表明,随着血吸虫感染致肝脏病变的逐渐加重,肝脏组织中一些主要的抗氧化物酶表达水平呈现明显下降,而氧化应激产物如MDA表达增多。提示血吸虫感染过程中肝脏整体组织水平发生氧化应激,抗氧化能力下降,并伴随着血吸虫感染肝脏炎症纤维化病变的加重而持续存在。进一步评价活性氧在血吸虫感染HSCs NLRP3炎症小体活化中的作用,我们发现抑制活性氧的生成能够有效阻止SEA诱导的HSCs NLRP3炎症小体形成和其下游主要效应分子Caspase-1、IL-1β的活性,从而减轻组织微环境中促炎因子的释放。这提示我们,HSCs活性氧的生成增多是虫源性因素诱导NLRP3炎症小体活化的重要因素,而炎症小体的活化促进Caspase-1酶活性的增强以及促炎细胞因子的释放导致肝脏局部炎症微环境的形成,最终引起肝脏纤维化的发生。综上所述,本研究发现在日本血吸虫感染所致肝脏病变中,在感染早期NLRP3炎症小体的活化参与了肝脏局部炎症微环境的形成;而伴随着HSCs的逐渐活化,HSCs内NLRP3炎症小体亦活化并随肝脏病变加重而持续存在。同时,虫源性因素SEA是促使HSCs内NLRP3炎症小体信号通路活化的重要外源性因素,而在其作用下所引发的HSCs内活性氧的释放可能是引发NLRP3炎症小体活化的重要机制之一。我们的工作着眼于NLRP3炎症小体,试验证明血吸虫病肝纤维化致病中HSCs存在NLRP3/caspase-1炎症小体信号通路活化,明确血吸虫感染相关PAMPs和DAMPs因子与肝星状细胞NLRP3/caspase-1通路活化的关系,解析了该信号通路在HSCs活化过程中的价值。同时,也为寻找治疗纤维化药物更为精确的作用靶点提供了依据。