内质网相关的蛋白质降解(Endoplasmic Reticulum-Associated Degradation，ERAD)系统是位于内质网的一类特殊的泛素蛋白酶体，主要通过降解滞留在内质网内的错误折叠蛋白来缓解内质网胁迫(ER stress)。ERAD系统通常围绕E3链接酶组织起大分子量的蛋白复合体来行使功能，根据酵母和动物中的研究，主要由两大复合体组成，分别是HRD1复合体和DOA10复合体。尽管目前关于这两个复合体的研究有很多，但是这两个复合体之间的调控关系还少有报道。正常生长条件下，细胞内的错误折叠蛋白较少，部分ERAD组分会通过ERAD平衡机制(ERAD tuning)下调自身蛋白含量从而使ERAD保持在较低的水平。目前关于ERAD tuning的研究还处在初步阶段。近几年，植物中关于ERAD的研究越来越广泛，本实验室前期工作证明HRD3A和UBC32均在植物ERAD过程中发挥功能，它们分别是HRD1复合体和DOA10复合体的成员。本论文以HRD3A和UBC32为切入点，深入地研究了两大复合体之间的关系。研究发现HRD1对UBC32存在ERAD tuning调控，而UBC32又对HRD1复合体组分AtOS9有调控作用，显示了HRD1复合体和DOA10复合体在一定程度上存在拮抗关系，该结果是目前植物中发现的第一个ERAD tuning范例。另一方面，我们深入研究了UBC32如何通过调控下游蛋白PIP2的稳定性参与干旱胁迫响应过程。　　研究发现，hrd3a和UBC32过表达在衣霉素(Tm)处理时表现类似的表型，通过western blot检测发现UBC32蛋白在hrd3a突变体中大量积累。HRD3A是HRD1复合体中HRD1 E3连接酶识别底物的关键组分，因而我们进一步检测了UBC32在HRD1突变体中的含量，发现与Wild type(WT)相比较，UBC32也在hrd1a/hrd1b双突变体中大量积累，而在其他几个预测参与ERAD的E3突变体中的含量没有显著差异。该结果说明UBC32特异地在HRD1复合体的突变体中积累。另一方面，利用多种方法证明UBC32受26S蛋白酶体的调控，它与HRD1A/HRD1B在体内和体外均存在相互作用。进一步我们发现，HRD1A/HRD1B均可以直接介导UBC32的泛素化修饰并促进其降解，但在hrd1a/hrd1b双突变体中，UBC32的降解速率则大幅减缓。共表达实验发现，HRD1可以增强UBC32的底物蛋白MLO12的稳定性，且这个结果是HRD1通过促进UBC32的降解间接实现的。遗传学证据表明，ubc32可以部分回复hrd3a对Tm敏感的表型。说明UBC32位于HRD1生化水平和遗传学水平的下游。此外，胁迫处理可以提高UBC32的稳定性，预示UBC32在该条件下可能从冗余蛋白变成功能蛋白。我们将HRD1调控UBC32的研究延伸到动物中，也揭示了动植物调控过程的类似性:UBE2J1蛋白受蛋白酶体调控;与对照相比，UBE2J1在HRD1si细胞中大量积累;在HRD1si和HRD1C1A显性负突变体中UBE2J1的降解速率也比对照中明显减慢。一系列的证据表明，在动物中，HRD1对UBE2J1也存在类似于拟南芥中的调控过程。综上所述，HRD1对UBC32(UBE2J1)的ERAD tuning调控在动植物中保守存在。　　此外，我们通过寻找UBC32调控的下游蛋白来阐述其参与胁迫响应的机理。我们发现UBC32负调控HRD1复合体组分AtOS9的蛋白含量，AtOS9的降解依赖于UBC32的E2活性。同时，atos9可以回复ubc32对Tm和NaCl不敏感的表型，说明UBC32对HRD1复合体也有反向调控作用。该结果也是植物中另一个支持ERADtuning的证据。另外，我们通过质谱方法鉴定到水通道蛋白PIP2与UBC32存在相互作用，并通过LCI(Luciferase Complementation Imaging)系统、BiFC方法和pull-down实验进行了互作验证。已知拟南芥中E3连接酶RMA1调控PIP2的稳定性并在植物响应干旱胁迫中起重要作用。研究发现PIP2在ubc32突变体中积累，进一步实验发现UBC32和RMA1形成E2-E3复合物来调控PIP2的蛋白稳定性，这可能是我们发现的ubc32突变体对干旱敏感而UBC32过表达对干旱不敏感的原因之一。综合以上结果，我们发现UBC32通过调控AtOS9、PIP2等下游蛋白的稳定性参与到不同胁迫响应过程。