本论文的研究内容主要包括两个部分：(1)汉逊酵母高效多基因阻断方法的建立；(2)狂犬病毒糖蛋白在汉逊酵母中的分泌表达研究。　　 随着汉逊酵母基因组测序的完成，人们对其研究进入后基因组阶段。然而，由于汉逊酵母同源重组效率低，到目前为止在汉逊酵母中研究特定基因功能时仍然没有一个高效基因阻断方法。此外，由于汉逊酵母糖基化的糖链结构与组成和人源的有很大不同，其表达的具有重要医疗价值的糖蛋白易引起人体的免疫排斥。因此，对汉逊酵母宿主菌的糖基化进行人源化改造，使其表达糖蛋白完全按照人体内糖蛋白的糖链结构与组成进行糖基化修饰，这将具有重要的医疗价值。为快速地破译其基因功能和改造汉逊酵母糖基化路径，我们采用了一种能在汉逊酵母中高效地阻断单基因或多基因的方法。该方法主要利用PCR扩增酶切连接构建基因阻断组件、截断筛选标记、共转化单链DNA和双链DNA及Cre-lox系统。首先，我们分别用PCR扩增目的基因的截断筛选标记双链DNA分子阻断组件和相应的单链DNA分子，其中阻断组件两端的同源臂在500 bp左右且截断筛选标记共有序列为300 bp左右，并利用化学共转化.H.polymorpha NCYC495，结果显示其正确基因阻断率可以达到60％-70％，其结果表明同源单链DNA分子可以作为激活同源重组的信号分子。为了能在同一宿主中实现无筛选标记的多基因阻断，我们分别利用正常的Cre-loxP和突变的Cre-lox阻断ALG3和URA5基因。然后在双突变株中转化pHFMDRZ-CRE-leu2通过诱导表达Cre重组酶，能高效地使loxP-marker-loxP和lox71-marker-lox66发生重组，导致在双突变株中分别在alg3和ura5基因中仅留下一个正常的loxP和一个突变的lox72，接着在无选择压力下丢掉载体pHFMDRZ-CRE-leu2，获得无筛选标记残留的突变株。　　 目前发展中国家用于动物狂犬病防疫的疫苗大部分仍然是弱毒活疫苗，虽然其制备相对容易，免疫期较长，但是在敏感动物体内存在毒力返祖的潜在危险。因此，狂犬病弱毒苗在发达国家早已禁止使用。用于人狂犬病防疫的疫苗主要是灭活疫苗，但其存在产量低、成本高、易受动物源性病毒的污染及难以大规模发酵生产的缺点。所以，研制一种经济、廉价且免疫效果良好的狂犬病疫苗在我国具有重要的经济和社会效益。为此我们用汉逊酵母表达系统表达狂犬病病毒糖蛋白，为研究新型狂犬病疫苗提供基础。通过PCR合成了糖蛋白胞外区DNA序列，并在其C端添加6xHis-tag标签，随后构建到分泌型表达载体中并在汉逊酵母中进行了表达研究。合成的糖蛋白基因在初筛中都没有发现明显的分泌表达，通过ELISA和Western blot我们对胞内表达情况进行了分析，结果发现，在胞内大量重组蛋白发生降解。于是我们在汉逊酵母中共表达分子伴侣和糖蛋白基因，以协助糖蛋白进行翻译后的正确修饰，稳定及分泌到胞外。通过ELISA检测，我们筛选到了分泌重组蛋白的共表达汉逊酵母来源的Cnel.(HpCne1)的重组工程菌(最高分泌量可达3.8 mg/L)。SDS-PAGE结果显示糖蛋白基因在发酵培养上清中表达为糖基化形式的蛋白，分子大小为80 kD，Western blot同样显示在80 kD处有特异性条带。而共表达汉逊酵母来源的Kar2(HpKar2)及酿酒酵母来源的Cncl(ScCnel)和Kar2(ScKar2)的工程菌株仍然没有筛选到分泌表达株，表明大量分泌表达糖蛋白的瓶颈可能主要在于翻译后的N-糖基化正确修饰。此外，这也意味着HpCne1.和ScCne1在功能上可能还存在着一些差异。用Ni2+柱亲和层析的方法我们得到了纯化的糖蛋白，并经Western blot分析表明：该重组蛋白能狂犬病毒抗体反应，其具有良好的反应原性。本研究所表达的重组糖蛋白，可作为适合我国国情的狂犬病重组疫苗的研究。　　 利用酵母表达系统进行表达外源蛋白，其表达量在很大范围内与细胞密度成正比，因此高密度发酵是提高发酵产量的一个非常有效的手段。我们利用5L发酵罐进行分批补料高密度培养进行发酵表达，对狂犬病毒糖蛋白(RGP)在重组H.polymorpha/pHFMD-HpCnel-MRG11＃工程菌中的高密度发酵表达工艺进行了优化，以确定最适发酵条件。通过分批补料培养方法探讨pH、不同诱导温度、甲醇流加速度及方式等因素对菌体的生长以及重组蛋白表达的影响。结果表明：表达温度在25℃，pH值为5.5，甲醇流加速度为6.8 ml/h/L时为最优发酵条件，诱导表达时间为42-48h。通过优化高密度发酵工艺，rRGP在发酵罐中的表达量比摇瓶培养提高4.1倍，达到约15.5 mg/L，为大规模制备rRGP蛋白奠定了基础。