背景与目的甲状腺癌是较为常见的头颈部恶性肿瘤,而乳头状癌是其最常见的病理类型,在甲状腺癌中占90%左右,近年来发生率呈上升趋势,目前,对甲状腺乳头状癌癌变机制的研究取得了一定的进展,但是其具体癌变机制仍不是特别的清楚,近年来研究发现一些抑癌基因其DNA序列完整,未发现有基因突变、基因缺失等变化,逐渐认识到表观遗传学,特别是DNA甲基化参与了肿瘤的发生与发展这一主要事件。由于DNA甲基化是可逆的,在一些去甲基化药物的作用下可逆转抑癌基因启动子区的甲基化状态,恢复其功能,起到抑制肿瘤生长的作用。目前主要有两种去甲基化药物：5-氮杂胞苷(5-azaC)及5-氮杂脱氧胞苷(5-azaCdR).5-azaC作为去甲基化的一种,在DNA复制过程中可与甲基转移酶结合从而形成共价复合物,使由于甲基化而失活的抑癌基因重新表达,恢复功能,从而起到抑制肿瘤细胞生长的目的。最近研究表明DKK3基因是一个新的候选抑癌基因,是经典Wnt信号传导通路的拮抗因子,DKK3基因属于Dickkopf家族,可通过与Wnt受体复合体竞争性结合,选择性抑制Wnt信号通路的活化,进而拮抗基因的沉默会使其失去对通路的抑制作用,导致细胞无限增殖,肿瘤形成。研究发现,由于DKK3基因启动子区富含CpG岛,而DKK3基因启动子区的高甲基化是导致DKK3基因表达失活的重要原因,在人类许多的肿瘤细胞系或恶性肿瘤组织,如胃癌、食管癌、大肠癌、前列腺癌、乳腺癌及肺癌等组织中表达下调或缺失,但在甲状腺乳头状癌中DKK3基因启动子甲基化及其转录表达状况,5-azaC对乳头状甲状腺癌细胞TPC-1细胞增殖及DKK3基因的影响国内外尚无文献报道。为此,我们运用半定量RT-PCR、甲基化聚合酶链反应(MSP)分别从RNA水平检测DKK3基因mRNA在PTC及对应癌旁组织NCE中的转录情况,从DNA水平检测DKK3基因启动子区域甲基化在PTC及对应癌旁组织NCE中启动子甲基化状况,并分析它们与临床病理特征的关系,接着采用甲基转移酶抑制剂5-氮杂胞苷(5-azaC)对甲状腺乳头状癌TPC-1细胞株进行干预,探讨DKK3基因在甲状腺乳头状癌中表达失活的机制,5-azaC对TPC-1细胞株生长增殖及其DKK3基因表达的影响,以此评判DKK3基因是否是甲状腺乳头状癌的候选抑癌基因,并寻找肿瘤治疗的新靶点。材料与方法1.运用半定量RT-PCR从RNA水平检测DKK3基因在49例PTC及NCE组织中的转录情况,应用甲基化聚合酶链反应(MSP)从DNA水平检测PTC及NCE组织中DKK3基因启动子的甲基化情况,并分析其与临床病理参数的关系。2.经2、5、10、20、50、100、200、400μmol/L的5-azaC处理乳头状甲状腺癌TPC-1细胞后,采用MTT观察药物对细胞生长的抑制作用；并以反转录-聚合酶链反应(RT-PCR),甲基化特异性PCR (methylation-specific PCR, MSP)检测细胞经5、10、20、50μmol/L的5-azaC处理后DKK3基因mRNA的表达以及DKK3基因启动子甲基化状态。3.采用SPSS10.0统计软件进行统计分析,数据处理：多样本均数的比较采用单因素方差分析,两样本率的比较采用四格表资料的X2检验,两样本定量资料采用t检验,以P<0.05为差异显著性的标准。结果1. NCE和PTC中,DKK3基因mRNA表达的阳性率分别为100%和44.9%,在NCE组织中,无1例出现DKK3基因启动子的甲基化,而在PTC组织中38.8%出现DKK3基因启动子甲基化,2组差异均有统计学意义(P<0.05); PTC中DKK3基因启动子的甲基化及mRNA的表达与患者的病理学分级、TNM分期、淋巴结转移有明显相关性(P<0.05)。2.甲状腺乳头状癌中DKK3基因启动子的甲基化与其mRNA表达有明显的负相关性(P<0.05)3.经不同浓度5-azaC处理TPC-1细胞后,随着药物作用时间的延长和药物浓度的增加,细胞的生长受到明显抑制,呈时间和剂量依赖性(P<0.05)；经5、10、20、50μmol/L药物浓度的5-azaC处理TPC-1细胞48h后,DKK3mRNA的相对表达量依次为0.208±0.017、0.365±0.013、0.489±0.017、0.582±0.011,表达强度与5-azaC药物浓度呈剂量依赖关系(F=370.356, P<0.01); MSP检测结果显示,经5-azaC处理后,DKK3基因启动子高甲基化的区域发生部分去甲基化(Fm=315.188,Fum=195.257;P<0.05)。结论1.DKK3基因启动子区域的甲基化是DKK3基因失活的重要机制,在PTC的发生、发展中起着重要作用。2.5-azaC能有效逆转乳头状甲状腺癌细胞TPC-1中DKK3基因的异常甲基化,从而增强DKK3基因表达,抑制肿瘤细胞生长。