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研究背景:Huber和Koessler在九十多年前对致死性哮喘的经典描述中首次提出了气道重塑的概念。临床上,气道重塑是引起哮喘患者出现不可逆性通气功能障碍的罪魁祸首。研究表明,增厚的气道平滑肌(ASM)层是引起哮喘患者产生气流受限的首要原因。细胞外基质(ECM)在正常气道内起物理支撑作用,哮喘中气道平滑肌细胞(ASMC)异常分泌的ECM不仅会加剧气道狭窄,还会反向促进ASMC异常增殖及分泌,形成气道重塑的恶性循环。因此,ASMC分泌ECM是哮喘气道重塑防治的重要靶点。肺内凝血是近年哮喘防治的研究热点。凝血系统中的关键蛋白酶凝血酶可以通过与特定的受体结合,发挥促炎、促增殖、促迁移等非凝血功能。凝血酶受体(PARs)中PAR-1与PAR-2在肺损伤及炎症性疾病中发挥重要作用,以PAR-1关系尤为密切。PAR-1在气道多种结构细胞如肺成纤维细胞、ASMC、上皮细胞的细胞膜上均有表达。目前尚未有报道表明凝血酶-PAR-1对气道ECM重塑的影响。达比加群酯是一种新型高效的直接凝血酶抑制剂,是最前沿的口服抗凝药物。基础研究发现,达比加群对凝血酶-PAR1介导的非凝血功能同样具有抑制作用。据此,我们推测凝血酶可能通过与ASMC胞膜上的PAR-1结合,激活下游ERK1/2信号通路,促进ECM沉积;而达比加群可以抑制这一效应。研究目的1.分离培养原代人气道平滑肌细胞并进行鉴定;2.明确凝血酶对ASMC ECM沉积的作用;观察PAR-1受体抑制剂SCH79797及ERK1/2信号通路抑制剂U0126对这一作用的影响;3.明确凝血酶对ASMC ERK1/2信号通路磷酸化水平的影响;观察SCH79797及U0126对这一作用的影响;4.明确达比加群干预凝血酶后,ASMC ECM沉积及ERK1/2信号通路磷酸化水平的变化。材料与方法1.取南方医科大学南方医院胸外科肺叶切除术患者标本,采用本课题组成熟的组织块贴壁法分离培养原代人气道平滑肌细胞。采用特异性免疫荧光染色技术进行细胞鉴定。2.选择RT-PCR及Western blot技术分别检测不同干预后ASMC ECM基因及蛋白的表达水平。3.选择Western blot技术检测不同干预后ASMC ERK1/2的磷酸化水平变化。4.数据统计:SPSS20.0软件统计,采用One-WayANOVA法进行分析,确定方差齐且组间差异有统计学意义后采用LSD法进行多重比较。P<0.05,差异即有统计学意义。结果(1)原代人气道平滑肌细胞在光镜下呈长梭形,生长融合后呈现“峰谷征”;经抗α-SMA抗体进行特异性染色后,可见胞质内均匀分布绿色荧光。(2)①用递增浓度的凝血酶(0.1-10U/ml)刺激细胞24h,COL-Ⅰ α1的表达均显著增加(P<0.01),1.0U/ml达最大效应;②用1.0U/ml的凝血酶刺激细胞不同时间(12-72h),COL-Ⅰα1的表达均显著增加(P<0.01),并在48h到达峰值;③用凝血酶(1.OU/ml)刺激细胞12h,COL-Ⅰα1、多功能蛋白聚糖、纤连蛋白mRNA表达均显著增加(P<0.01),而胶原蛋白Ⅲ、层黏连蛋白α1、α2 mRNA表达与对照组相比无明显差异;④SCH79797及U0126均能显著抑制凝血酶诱导的COL-Ⅰα1(P<0.01)及ECM基因(P<0.05)的表达增加。(3)①凝血酶(1.OU/ml)刺激细胞不同时间(5-60min),ERK1/2磷酸化水平显著上升(P<0.05),呈早期快速磷酸化模式,5min达最大效应;②SCH79797及U0126均能显著抑制凝血酶诱导的ERK1/2快速磷酸化(P<0.01)。(4)达比加群提前干预细胞30min后,与对照组相比,能显著抑制凝血酶诱导的COL-Ⅰα1(P<0.01)、ECM基因(P<0.05)的表达增加、并能抑制凝血酶诱导的ERK1/2快速磷酸化(P<0.01)。结论1.采用组织块贴壁法可成功分离培养出原代人气道平滑肌细胞。2.凝血酶作用于ASMC上PAR-1快速活化下游ERK1/2信号通路,诱导ECM沉积;达比加群可以抑制这一效应。