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随着人口老化、侵入性检查增多、造影剂和化疗药物的广泛使用,住院病人急性肾损伤(Acute Kidney Injury,AKI)的发病率和死亡率逐年增高。既往认为AKI后肾脏功能可以恢复正常,不影响肾脏寿命。但流行病学研究表明,即使是肾功能恢复正常的AKI患者,10年内仍有约25%进展为慢性肾脏病(Chronic Kidney Disease,CKD),死亡风险增加50%。因此,AKI与CKD被认为是相互交联的综合征。目前临床尚无有效方法阻遏AKI向CKD的进展。研究表明,外源性间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)治疗可以减轻顺铂、甘油以及缺血再灌注(Ischemia/Reperfusion,I/R)诱导的小鼠AKI。但该细胞对急性肾损伤慢性化的效应目前研究较少,且文献中使用的细胞多为骨髓来源。脂肪来源MSCs方便获取,且有比骨髓来源MSCs更强的体外扩增能力,因此本研究采用了人脂肪来源间充质干细胞(human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells,hAD-MSCs)进行相关研究。研究表明,AKI后肾小管上皮细胞(Tubular Epithelial Cells,TECs)的Sox9被明显激活,且有超过40%的Sox9阳性细胞也是Ki67阳性的,因此Sox9的激活促进了损伤TECs的内源性修复。鉴于,MSCs和Sox9都有促进AKI修复与再生的能力,我们猜想hAD-MSCs可能通过旁分泌外泌体,进而激活TECs中Sox9的表达,减轻AKI及其慢性化。本研究中,我们成功建立了小鼠单侧I/R模型,尾静脉注射体外培养和扩增的hAD-MSCs,发现该细胞促进了TECs中Sox9的激活,明显减轻AKI及其慢性化;我们同时提取了hAD-MSCs的外泌体,发现其外泌体有同细胞相似的保护作用,而使用抑制外泌体释放的药物则阻断了Sox9的激活,抑制了该保护效应,进一步证实hAD-MSCs的保护作用是通过旁分泌效应来实现的;我们在体外将hAD-MSCs或其外泌体同TECs及胚胎成纤维细胞共培养,发现hAD-MSCs可以激活TECs中Sox9的表达,抑制转化生子因子-β1(Transforming Growth Factor-β1,TGF-β1)诱导的TECs向促纤维化表型的转变,抑制外泌体的释放则阻断该效应;但hAD-MSCs对胚胎成纤维细胞激活为肌成纤维细胞则无明显抑制作用。综上所述,hAD-MSCs通过旁分泌外泌体,激活TECs中Sox9的表达,促进肾脏的修复与再生,进而阻遏AKI及其慢性化的进展。第一部分h AD-MSCs减轻急性肾损伤并促进肾脏修复目的观察h AD-MSCs治疗小鼠单侧肾脏I/R 5天后肾脏病理、炎症细胞浸润、损伤及修复相关因子的表达情况,探讨h AD-MSCs对I/R诱导的小鼠AKI的保护效应及可能的作用机制。方法构建C57BL/6小鼠左侧肾脏I/R模型,24小时后尾静脉注射体外扩增的h AD-MSCs,5天后取肾脏和外周血标本。检测指标如下:1)肾脏病理:肉眼观察皮髓交界处缺血带的变化,PAS染色观察肾脏病理的改变;2)损伤相关分子:免疫荧光观察肾脏损伤分子(Kidney Injury Molecule-1,Kim-1)的表达;3)修复相关因子:免疫荧光观察残存近端小管(LTL)的数目、小管上皮细胞Sox9的激活情况;4)炎症细胞浸润:流式细胞术检测肾脏组织炎症细胞浸润的变化(巨噬细胞、T淋巴细胞);5)TECs的增殖和凋亡:免疫荧光双染(Ki67和Vimentin)检测TECs的有效增殖;TUNEL荧光观察TECs凋亡的变化,Western Blot(WB)检测肾脏Bcl-2、Bax的表达;6)AKI-CKD标记物:荧光双染检测肾小管上皮细胞G2/M期阻滞(PH3和Ki67),荧光检测管周毛细血管网(CD31),WB检测肾脏缺氧诱导因子(Hif-1α)的变化。结果与I/R组相比较,h AD-MSCs治疗后肾脏缺血带缩小、病理损伤减轻;Kim-1的表达减少;残存的TECs增多,TECs上Sox9的表达增加;肾脏炎症细胞浸润减少;TECs凋亡减少、有效增殖增加;阻滞于G2/M期的TECs明显减少,管周毛细血管网密度增大,肾脏缺氧改善。结论h AD-MSCs治疗减轻了缺血再灌注所致的小鼠急性肾损伤,并促进肾脏的修复。该作用可能是由于h AD-MSCs治疗减少了肾脏炎症细胞浸润,促进肾小管上皮细胞有效增殖,减轻细胞周期阻滞,改善了肾脏缺血缺氧的微环境所产生的。第二部分h AD-MSCs减轻I/R诱导的慢性肾间质纤维化目的观察h AD-MSCs治疗小鼠单侧肾脏I/R 28天后肾脏胶原纤维沉积、纤维化相关因子的表达变化,探讨h AD-MSCs对单侧肾脏I/R诱导的小鼠慢性肾间质纤维化的保护效应及可能的作用机制。方法构建C57BL/6小鼠左侧肾脏I/R模型,24小时后尾静脉注射体外扩增的h AD-MSCs,28天后取肾脏标本。检测指标如下:1)肾脏大小:肉眼观察肾脏大小的变化,计算肾脏重量的差值(右侧肾重减去左侧肾重);2)损伤相关分子:免疫荧光观察肾脏损伤分子(Kim-1)的表达;3)Sox9:免疫荧光观察TECs中Sox9的表达;4)间质胶原纤维沉积:Masson和天狼星红染色观察肾脏胶原纤维沉积的变化;5)纤维化相关因子:免疫荧光检测α-SMA、Col-Ⅳ的表达变化,WB检测α-SMA、PDGFR-β的表达变化;RT-PCR检测α-SMA、PDGFR-β、Col-Ⅳ以及Fibronectin的表达变化。结果与I/R组相比较,h AD-MSCs治疗后左侧肾脏体积增大,右侧与左侧肾脏的差值减小;肾脏损伤减轻;肾间质胶原纤维沉积减少,纤维化相关因子的表达减少。结论h AD-MSCs治疗减轻了缺血再灌注诱导的小鼠慢性肾间质纤维化。该作用可能是由于h AD-MSCs治疗明显减轻了急性期肾脏的损伤,使更多受损的TECs在急性期得以修复,重新进入细胞周期进行增殖;h AD-MSCs治疗后急性期肾间质炎症细胞浸润减少,炎性细胞因子和趋化因子的分泌也减少,间质肌成纤维细胞的激活随之减少。故而进入慢性期的损伤细胞数目明显减少,肾间质纤维化得以减轻。第三部分h AD-MSCs通过其外泌体激活肾小管上皮细胞Sox9的表达目的观察h AD-MSCs来源外泌体对肾小管上皮细胞Sox9的表达、纤维化相关因子表达的影响,深入探讨h AD-MSCs治疗急性肾损伤及其慢性化的机制。方法体内:构建C57BL/6小鼠左侧肾脏I/R模型,24小时后尾静脉注射h AD-MSCs来源的不同浓度的外泌体,加或不加抑制外泌体释放的药物(GW4869),7天后取肾脏标本。1)细胞示踪:PKH-26染色h AD-MSCs、GFP小鼠提取m AD-MSCs,分别经尾静脉注射入I/R小鼠体内,检测带荧光的细胞;2)分化:荧光双染(GFP和LTL),观察有无LTL阳性的GFP细胞;3)外泌体的鉴定:WB检测外泌体膜表面分子CD63的表达,电镜检测外泌体的大小和形态;4)外泌体的浓度:尾静脉注射h AD-MSCs来源的外泌体,摸索出能使肾脏纤维化水平降低的外泌体的最适浓度;5)纤维化相关因子:WB检测α-SMA、PDGFR-β的表达变化;6)Sox9:免疫荧光检测肾组织中Sox9的表达变化;荧光双标(Sox9和Kim-1)检测损伤管的修复情况,荧光双标(Sox9与LTL)检测残存管的变化。体外:将h AD-MSCs或者其外泌体同TGF-β1处理的原代TECs或胚胎成纤维细胞系(NIH3T3)进行共培养,加或不加GW4869。1)纤维化相关因子:WB检测h AD-MSCs对TGF-β1刺激的TECs、NIH3T3细胞系促纤维化因子(α-SMA、Col-Ι、Fibronectin)表达的影响;PCR检测h AD-MSCs对TGF-β1刺激的TECs、NIH3T3细胞系纤维化相关因子(TGF-β1、CTGF、α-SMA、Col-Ι、Fibronectin)分泌的影响。2)Sox9:PCR检测h AD-MSCs对TGF-β1刺激的TECs、NIH3T3细胞系Sox9表达的影响。结果体内:在h AD-MSCs治疗后的肾脏中仅找到少数带有荧光标记的细胞,这些细胞并未分化为肾小管上皮细胞。与I/R组相比较,h AD-MSCs来源的外泌体治疗后肾小管上皮细胞Sox9的激活增加,肾间质纤维化减轻,呈剂量依赖性;药物阻断外泌体的释放则抑制了Sox9的激活,肾间质纤维化加重。体外:h AD-MSCs及其外泌体促进TGF-β1刺激的TECs中Sox9的激活,抑制了TECs向促纤维化表型的转变,但对胚胎成纤维细胞激活为肌成纤维细胞无明显作用。结论h AD-MSCs通过其外泌体激活肾小管上皮细胞Sox9的表达,从而减轻肾间质纤维化。