目的利用N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)和胶原蛋白合成一种温度敏感的、可注射、可降解的、并有一定机械强度的新型水凝胶原蛋白胶,并对其体外理化性质进行检测。方法本试验主要利用甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)引发ε-己内酯(CL)开环聚合,得到疏水性更强,降解更缓慢的疏水性大分子单体甲基丙烯酸羟乙酯-聚己内酯(HEMAPCL),然后将它与N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)和亲水单体丙烯酸(AAc)共聚,得到三元接枝共聚物。其中甲基丙烯酸羟乙酯-聚己内酯(HEMAPCL)是通过甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)的端羟基来引发己内酯(CL)开环聚合得到的,该反应使用常用的异辛酸亚锡作为催化剂来进行。Poly(NIPAAm-co-AAc-co-HEMAPCL)三元无规共聚物是由NIPAAm、AAc和HEMAPCL三种单体通过自由基聚合得到的,聚合体系为溶液聚合。此共聚物与Ⅰ型胶原蛋白进行生物耦合最终生成本试验所要求得到的新型温度敏感水凝蛋白胶。对合成的新型水凝胶我们进行了与其物理化学性质有关的溶胶-凝胶转变表征、注射能力、降解行为研究、水含量测试水凝胶毒性检测、旋转流变分析、水凝胶形貌扫描电子显微镜观察等检测。结果我们对新型胶合成中的NIPAAm/AAc/HEMAPCL的投料比进行了优化,得出最佳投料比为88/9.6/2.4。当作为骨架作用的Poly(NIPAAm-co-AAc-co-HEMAPCL)三元无规共聚物与Ⅰ型胶原蛋白进行生物耦合后,最终生成本试验所要求得到的新型温度敏感水凝蛋白胶。检测结果表明该新型胶由液态转为固态的低临界溶液温度(LCST)相对较低,约为29.7℃,此温度适宜于与干细胞进行联合应用注射移植。细胞毒性结果显示新型胶及其降解产物均为低毒性,细胞相容性好。新材料在37℃,15%重量比凝胶状态下测得最大强度为80000Pa,具有较高的强度。结论成功合成了一种温度敏感的、可降解的、组织相容性好并具有一定物理强度的新型水凝蛋白胶。第二部分C57/BL6小鼠骨髓间充质干细胞的培养和鉴定目的为检验新型水凝胶原蛋白胶的细胞毒性及为体内细胞种植试验提供理想的干细胞来源,建立一种体外纯化及培养扩增C57/BL6小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的简单有效方法。方法利用骨髓MSCs在体外培养皿中培养时具有贴壁生长的特性,采用全骨髓法分离培养C57/BL6小鼠MSCs,通过体外培养和连续传代达到纯化和扩增MSCs目的,并与以优化。倒置显微镜下观察细胞形态变化情况；利用四唑盐比色(MTT)法测定MSCs的生长曲线：流式细胞仪(FCM)鉴定MSCs膜抗原。结果C57/BL6小鼠胫骨全骨髓细胞在分离后与含15%优质胎牛血清DMEM/F12培养基混合,约5-10分钟后即可见大量有核细胞贴壁,细胞形态为圆形,24-48小时后可见贴壁细胞转变为椭圆形、多角形及短梭形,7-12天时细胞呈长梭形并达到90%单层融合。通过传代细胞进一步纯化及扩增。细胞传代后2天内处于潜伏期,3天后进入生长期,5天后进入平台期。第4代MSCs进行FCM检测CD45、CD44、CD29和CD54阳性率分别为2.4%、83.2%、95.1%和94.1%。激光免疫共聚焦结果显示造血细胞表面标物CD34和CD45阴性,而CD44和CD105阳性。结论C57/BL6小鼠全骨髓贴壁法能有效得到分离纯化的MSCs,用此方法培养的C57/BL6小鼠MSCs生长稳定,增殖能力活跃,具有MSCs的一般生物学特性,可以为组织工程提供理想的种子细胞。第三部分C57/BL6小鼠急性心肌梗塞模型制备方法及经验总结目的为检验新型水凝胶原蛋白胶与干细胞联合移植治疗缺血性心脏病的效果,需要建立C57/BL6小鼠急性心肌梗死模型,对建立模型中各可能导致其死亡或失败的步骤及原因进行总结和改良,提高建模过程中的可靠性、稳定性及可重复性,并减少其死亡率。方法40只C57/BL6小鼠腹腔内注射苯巴比妥钠全身麻醉后,气管切开并插管,小动物呼吸机辅助呼吸。常规消毒铺巾后,切开左胸前区皮肤,经左侧第3、4肋间进入胸腔暴露心脏,明确左前降支冠状动脉后结扎造成急性心肌梗死。对围手术期各种可导致其结扎失败和死亡的原因如：麻醉、人工辅助呼吸、开胸过程及结扎冠状动脉位置等进行分析和改进。结果成功建立了C57/BL6小鼠急性心肌梗死模型。术后24小时C57/BL6小鼠存活率为95%,4周时存活率为92.5%。术后第4周时处死C57/BL6小鼠,肉眼见左室前壁结扎线以下及心尖部心室扩张,呈室壁瘤样改变,病理切片见心肌梗死区以上心肌有代偿性肥大表现,而心肌梗死区心肌坏死并呈纤维化改变。结论通过方法改进我们能够快速有效建立C57/BL6小鼠急性心肌梗死模型并降低建模过程中C57/BL6小鼠死亡率。提高C57/BL6小鼠急性心肌梗死模型建立质量的相关因素有正确的麻醉方法、小动物呼吸机的合理使用、肺损伤的减少、左前降支冠脉动脉的正确结扎等。对以上各点的改进和重视可显著提高C57/BL6小鼠急性心肌梗死模型的成功率并减少C57/BL6小鼠死亡率。第四部分新型水凝胶原蛋白胶结合骨髓间充质干细胞移植治疗缺血性心脏病的基础研究背景虽然现有研究发现干细胞移植治疗可以改善心肌梗死动物模型心脏功能,但是由于移植后细胞有在心肌局部留滞率低,而远处组织器官中的再分布率高的缺点,限制了其在临床上的应用泛围。目的通过实验合成的新型水凝蛋白胶与骨髓间充质干细胞联合移植入急性心肌梗死动物心脏梗死心肌局部,探讨其可行性及有效性。方法全骨髓贴壁法分离纯化雄性C57/BL6小鼠骨髓间充质干细胞。将分离纯化后的MSCs转染红色荧火虫荧光蛋白酶基因,并在移植前作细胞核DAPI染色标记,体外观察细胞转染率及标记率。雌性约3周龄C57/BL6小鼠左前降支冠状动脉予以结扎制作急性心肌梗死模型,将128只雌鼠并随机分为四组,每组均为32只。第一组结扎左前降支冠状动脉后10分钟,在梗死区域、梗死区边缘局部共注射约50uL无血清的DMEM/F12培养基。第二组在相同时间、相同部位注入约50uL水凝胶。第三组注入50uL含有1×106个MSCs的无血清培养基。第四组注入50uL含有1×106个MSCs的水凝胶。分别在术后2小时、24小时、7天、28天处死小鼠,心脏组织作HE、Masson病理染色检查。同时每组每时间点取6只小鼠心脏作RT-PCR检测,测定心脏中移植干细胞的数量值。每组四只小鼠在术后第2小时、24小时及28天作小动物活体成像检查,在活体内观察移植干细胞的具体分布及活性情况。各组动物在术后当时及术后第28天时作小动物超声心动图检查,评定心脏功能改变情况。结果real time-PCR及小动物活体成像结果发现移植后干细胞在第4组梗死心肌局部的留滞率远高于第3组。同时活体成像还发现第4组移植后干细胞的远处转移率明显低于第3组。术后第28天时,第4组心脏局部还可见MSCs活性信号,而第3组MSCs信号基本消失(P<0.001)。各组术后即刻超声心动图结果发现术后心脏功能EF、FS均有下降,但组间无显著性差异(p>0.05)。术后第28天时心功能EF、FS结果表明第1组和第2组之间无统计学差,即单纯局部应用水新型水凝胶没有心脏功能保护性作用。第3组和第4组心脏功能EF、FS均有改善,与第1、2组之间有显著性差异(P<O.001),与第3组比较,第4组的心脏功能EF、FS有显著性提高(P<0.001)。结论新型温度敏感水凝胶结合干细胞移植可明显提高干细胞在心脏局部的留滞率,减少其远处分布,进而提高干细胞治疗缺血性心脏病的治疗效果。单独应用水凝胶没有心脏保护作用。