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研究背景MECP2基因突变导致孤独症谱系病,其中主要包括Rett syndrome(RTT,OMIM#312750),它是一种严重神经系统发育倒退性疾病。典型的RTT有6-18个月正常发育阶段,随后逐渐出现以下4个主要特征:获得性语言或运动功能缺失、共济失调及刻板运动。MECP2基因编码的核蛋白MeCP2含有三个高度保守AT-hook结构域。前期我们发现携带位于AT-hook 1的突变的RTT患者,但AT-hook 1的生物学功能研究尚未见报道。因此,为阐明AT-hook 1在MeCP2蛋白中的作用,我们构建了携带有AT-hook 1保守结构域缺失的突变鼠,即Mecp2ΔAT-hookl/y鼠;并观察Mecp2ΔAT-hookl/y鼠的是否有RTT样行为学改变,分析突变鼠分子水平变化,以阐明MeCP2蛋白的AT-hook 1结构域的生物学功能。研究目的1.构建携带有MeCP2蛋白的AT-hook 1结构域缺失的雄性突变小鼠(Mecp2ΔAT-hook1/y 鼠)。2.观察Mecp2ΔAT-hook1/y模型鼠是否有RTT样行为学改变。3.通过Western blot分析,检测Mecp2ΔAT-ook1/y模型鼠不同脑区内MeCP2蛋白量的变化、及AT-hook 1缺失是否影响组蛋白H3二甲基化物表达水平。4.通过实时定量PCR法,检测Mecp2ΔAT-hook1/y模型鼠大脑、小脑区抑制性神经元相关基因RNA表达变化。研究方法1.利用CRISPR/Cas9基因编辑工具构建Mecp2ΔAT-hook1/y突变鼠,PCR测序进行基因编辑验证。2.行为学检测实验动物分为野生型(WT)和Mecp2ΔAT-hookl/y突变型(MUT)两组。行为学实验如下:2.1滚筒实验检测24周龄及34周龄模型鼠的运动功能2.2开场实验及高架十字迷宫检测24周龄及34周龄模型鼠焦虑探索功能2.3主动回避实验检测小鼠学习记忆功能2.4直接社会交流实验及筑巢实验检测小鼠社会学功能2.5甩尾实验及热板实验检测24周龄模型鼠痛觉功能3.Western blot分析检测模型鼠不同脑区的MeCP2蛋白、组蛋白H3甲基化(H3K4me2、H3K9me2、H3K27me2)蛋白表达水平变化4.实时定量PCR检测模型鼠大脑、小脑区抑制性神经元相关基因(AI593442,cabp7,gabra3,kcng4,nxph4,opn3,rassf8,robo2,scg2)RNA 表达水平5.运用尼氏染色及免疫组化的方法检查测模型鼠脑内组织病理变化。6.统计分析本研究全部数据均采用SPSS20.0及GraphPad Prism 6.05统计分析软件进行分析,两组间比较采用独立样本t检验分析;检验水准α=0.05,P<0.05有统计学意义。主动回避实验运用重复测量方差分析,两两组对比使用LSD分析。结果1.经鼠尾基因鉴定,我们成功构建了携带有MeCP2的AT-hook 1结构域缺失的突变鼠,即Mecp2ΔAT-hook1/y小鼠。2.经过2年观察,我们发现突变鼠生存率、体重、脑重及脑体积等均未见明显改变,另外,突变鼠脑组织未见明显神经元丢失及形态学上的改变。3.行为检测:我们发现在滚筒实验中,突变鼠运动功能障碍;在开场实验中,突变鼠自发运动减少,焦虑行为增加。高架十字迷宫检测,突变鼠焦虑行为增加;主动回避实验中,24周龄突变鼠学习记忆能力比野生鼠强,而40周龄突变鼠学习记忆能力下降;直接社会交流实验及筑巢实验中,两组小鼠行为表现无明显差异。甩尾痛觉实验中,突变鼠与野生鼠热反应表现无差异,但在热板痛觉实验中,突变鼠出现疼痛反应时间要比野生鼠晚,表示突变鼠痛觉受损。4.Western blot:24周龄突变鼠大脑内MeCP2蛋白表达量比野生鼠显著性增加;相反,在小脑内,突变鼠MeCP2蛋白表达量比野生鼠显著性减少。相比正常野生鼠,48周龄雄性MeCP2突变鼠皮层内的MeCP2蛋白表达量任然保持增加,但是海马、纹状体、小脑的MeCP2蛋白表达量无明显变化。24周龄突变鼠大脑内的H3K27me2蛋白表达量要比野生型鼠要多,而H3K4me2及H3K9me2两组小鼠并未见明显差异;突变鼠小脑内H3K4me2、H3K9me2及H3K27me2蛋白表达水平皆比野生型鼠要少。5.实时定量PCR:在24周龄小鼠大脑内,突变鼠的Cabp7,Kcng4,Nxph4,Rassf8 RNA表达水平比野生鼠少,而Robo2,Scg2 RNA表达量增高;在小鼠小脑内,突变鼠Cabp7及Nxph4 RNA表达量相比野生鼠少,而Kcng4则是增加。结论1.Mecp2ΔAT-hook1/y鼠有RTT样行为改变,说明AT-hook 1对MeCP2正常功能的维持起着非常重要作用。2.Mecp2ΔAT-hook1/y鼠脑内H3甲基化蛋白及部分抑制性神经元基因的RNA表达皆发生变化。由此推测,Mecp2ΔAT-hook1/y鼠由于AT-hook 1功能破坏,可能导致了突变鼠脑H3甲基化表达发生改变,从而影响了体内部分基因转录,进而使得小鼠发生行为学改变。这些结果从分子水平进一步阐明了 AT-hook 1对MeCP2的正常功能发挥的重要性。