冠状病毒具有广泛的天然宿主,可感染人类、畜、禽和其他脊椎动物,且具有跨物种传播能力。感染猪肠道的冠状病毒主要有甲型冠状病毒属的猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus,TGEV）、猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）和猪甲型肠道冠状病毒（Swine enteric alphacoronavirus,SeACoV）以及丁型冠状病毒属的猪丁型冠状病毒（Porcine deltacoronavirus,PDCoV）。目前对养猪业危害最为严重的猪肠道冠状病毒为PEDV和PDCoV。本研究系统地进行腹泻样品病毒鉴定、病毒分离、病毒入侵的细胞受体研究以及通过建立病毒反向遗传操作系统探究病毒关键致病基因,以期能够更全面深入地了解猪肠道冠状病毒入侵和致病机制,为疾病防控和疫苗研发提供参考和理论依据。本研究首先对浙江某猪场临床腹泻样品进行病原鉴定,以猪肠道冠状病毒特异性检测引物,通过RT-PCR对腹泻样品核酸进行检测,结果显示该腹泻样品只有PDCoV核酸检测阳性,TGEV、PEDV及SeACoV均为核酸阴性。随后通过LLC-PK1细胞成功地从腹泻样品中分离出病毒,经过病毒基因组cDNA扩增、序列比对及PDCoV结构蛋白抗体的IFA鉴定,确定从腹泻样品中分离出的病毒为PDCoV。将PDCoV全基因组序列与GenBank中已公布的其他毒株序列进行进化树分析发现,本研究获得的PDCoV为中国株。其S基因与CH-WH-2017（MK040451）同源性最高。全基因组重组分析发现该毒株非结构蛋白基因可能来自 CHJXNI2/15（KR131621.1）与 CHN-HG-2017（MF095123.1）重组演化。随后本研究对PDCoV病毒入侵细胞的受体进行研究。通过推测并验证PDCoV S蛋白S1结构域能够通过猪氨基肽酶N（Porcine aminopeptidaseN,pAPN）结合到PDCoV易感细胞膜上,且可溶性pAPN蛋白能够阻断这种结合,体内外实验证实PDCoVS1蛋白能够与pAPN蛋白相互作用。外源表达pAPN蛋白能够介导PDCoV对非易感细胞的入侵和病毒增殖,产生的子代病毒同样具有感染能力。pAPN蛋白敲低实验进一步证实PDCoV对易感细胞的感染能力与细胞pAPN表达量呈正相关,表明pAPN能够作为PDCoV细胞受体介导病毒入侵感染。pAPN蛋白敲除实验则显示,易感细胞pAPN蛋白完全缺失后,仍然有少量PDCoV感染,说明除pAPN外,还存在有其他受体蛋白。为更好地研究猪肠道冠状病毒致病性,本研究尝试建立PDCoV病毒反向遗传操作系统。分段扩增病毒全长基因组,利用人工染色体组载体系统（BAC）为载体,通过同源重组方式将病毒全长基因组克隆到载体上,成功构建病毒全基因组感染性克隆质粒。通过转染细胞,在转染代细胞和感染第一代细胞均检测到病毒结构蛋白表达。至此,PDCoV反向遗传操作技术平台基本建立。以同样的感染性克隆构建方法和病毒拯救技术,本研究成功建立猪肠道冠状病毒PEDV的反向遗传操作系统。基于该系统,本研究对PEDVORF3基因及S蛋白C端7个氨基酸编码基因分别及同时进行缺失,成功获得基因修饰病毒,随后通过仔猪攻毒试验研究病毒致病性变化。实验结果发现ORF3及S蛋白C端7个氨基酸分别缺失均能一定程度致弱病毒,共同缺失后病毒致弱效果更为显著。随后本研究通过高致病性基因Ⅱ型PEDVS基因替换为低致病性基因Ⅰ型S基因的嵌合病毒仔猪致病性实验,证实病毒S基因为影响病毒毒力的关键基因,同时S基因以外的病毒基因同样会在病毒毒力中发挥作用。综上所述,本研究从分子病毒学水平研究了猪肠道冠状病毒细胞入侵和致病机制。成功分离获得一株猪肠道冠状病毒,并鉴定出其细胞入侵受体,通过建立反向遗传操作系统,证实猪肠道冠状病毒S基因是影响病毒毒力的主要因素。