猪的脂肪沉积是影响猪经济性状的重要因素之一,能够直接影响猪的生产效率、猪肉品质、繁殖性能和抗病力等,从而影响生猪养殖的经济效益。因此,深入了解脂肪沉积过程及其调控机制,对改善猪体脂的合理沉积,促进养猪业的健康发展具有重要意义。猪脂肪细胞的分化过程决定了猪的体脂沉积,脂肪细胞分化受到多种因素的影响。研究表明,表观遗传修饰对脂肪细胞分化具有重要的调控作用。N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine,m6A）是真核生物mRNA上分布最广泛、含量最丰富的甲基化修饰,能够动态可逆的调控mRNA代谢和加工过程,是近年来表观遗传学领域研究的前沿热点。FTO是第一个被鉴定的m6A去甲基化酶,同时也是第一个被发现的肥胖基因,与脂肪细胞分化密切相关。研究发现,m6A甲基化在个体发育、细胞分化及癌症发生等多种重要的生物学过程中发挥着关键的调控作用。本课题组前期研究发现,脂肪型金华猪的皮下脂肪和肌内脂肪含量均显著高于瘦肉型长白猪;而金华猪脂肪组织的mRNA m6A甲基化水平显著低于长白猪,提示m6A水平与猪脂肪沉积呈负相关,但是m6A对猪脂肪细胞分化的影响和调控机制尚不明确。因此,本研究首先探究了 FTO及其m6A去甲基化酶活性对猪前体脂肪细胞成脂分化的影响;从信号通路、克隆增殖和细胞自噬的角度,进一步探讨了 m6A调控猪脂肪细胞分化的分子机制;在此基础上,发现了表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）通过靶向FTO-m6A途径调控脂肪细胞分化。主要结果如下:1.FTO对猪前体脂肪细胞成脂分化的影响以猪原代前体脂肪细胞为研究对象,发现干扰FTO显著抑制猪脂肪细胞分化、细胞甘油三酯积累以及成脂标志基因PPARγ、C/EBPα和FABP4的基因表达;超表达FTO则促进猪脂肪细胞分化、细胞甘油三酯积累以及成脂标志基因的表达。通过构建FTO野生型（FTO-WT）和酶活位点突变型（FTO-MUT）质粒并进行细胞转染,发现超表达FTO-WT促进猪脂肪细胞分化,而超表达FTO-MUT则无显著影响,说明FTO对猪脂肪细胞分化的促进作用依赖于其m6A去甲基化酶活性。2.FTO调控猪前体脂肪细胞成脂分化的机制研究2.1 FTO通过JAK2-STAT-3-C/EBPβ通路调控脂肪细胞分化的机制在猪前体脂肪细胞中干扰FTO显著抑制JAK2的蛋白表达,降低STAT3磷酸化水平和成脂分化关键转录因子C/EBPβ的基因表达,提示FTO可能通过JAK2-STAT3-C/EBPβ信号通路调控猪脂肪细胞分化。通过meRIP-qPCR实验,发现干扰FTO提高JAK2mRNA m6A水平。通过点突变技术和双荧光素酶报告基因实验,发现将JAK2的m6A位点突变后,干扰FTO则无法降低JAK2的蛋白表达,提示FTO通过m6A修饰调控其蛋白表达。进一步探究m6A调控JAK2表达的机制,通过RIP-qPCR实验,发现m6A结合蛋白YTHDF2能够与JAK2 mRNA结合。通过mRNA稳定性检测实验,发现干扰YTHDF2提高JAK2 mRNA稳定性。以上结果表明,FTO通过m6A甲基化调控JAK2-STAT3-C/EBPβ信号通路,进而促进猪脂肪细胞分化。2.2 FTO通过克隆增殖调控脂肪细胞分化的机制利用FTO酶活抑制剂MA2对不同分化阶段的细胞进行处理,发现MA2主要在分化前期（0-2天）发挥抑制成脂分化的作用。通过流式细胞仪检测细胞周期,发现干扰FTO降低G2期的细胞数量,提高G1期和S期的细胞数量。进一步研究发现,干扰FTO显著减少了调控S期向G2期转换的细胞周期关键基因CCNA2和CDK2的蛋白表达。通过meRIP-qPCR实验,发现干扰FTO提高CCNA2和CDK2 mRNA m6A水平,提示FTO通过m6A调控其蛋白表达。进一步探究m6A调控CCNA2和CDK2表达的机制,发现YTHDF2能够特异性结合CCNA2和CDK2 mRNA,干扰YTHDF2提高其mRNA稳定性。以上结果表明,干扰FTO通过m6A途径降低CCNA2和CDK2的蛋白表达,阻滞克隆增殖进程,抑制猪脂肪细胞分化。2.3 FTO通过细胞自噬调控脂肪细胞分化的机制通过RNA测序,发现在猪前体脂肪细胞中干扰FTO显著降低自噬关键基因ATG5和ATG7的基因表达,提示FTO通过细胞自噬途径调控猪脂肪细胞分化。通过免疫荧光染色和透射电子显微镜观察等实验,发现超表达FTO提高细胞内自噬流的产生和自噬体的数量,促进脂肪细胞分化;干扰FTO则降低细胞自噬水平,抑制脂肪细胞分化,证明FTO通过细胞自噬途径促进脂肪细胞分化。进一步研究发现,干扰FTO提高ATG5和ATG7 mRNA m6A水平。将ATG5和ATG7的m6A位点突变后,超表达FTO则无法影响其蛋白表达,提示FTO通过m6A修饰调控其蛋白表达。进一步探究m6A调控ATG5和ATG7表达的机制,发现YTHDF2能够与ATG5和ATG7 mRNA特异性结合,干扰YTHDF2提高其mRNA稳定性。以上结果表明,FTO通过m6A修饰靶向调控ATG5和ATG7的蛋白表达,提高细胞自噬,进而促进猪脂肪细胞分化。3.EGCG靶向FTO调控脂肪细胞分化的机制研究EGCG是绿茶茶多酚的主要组成成分。利用不同浓度（0、50、100、200 μM）的EGCG处理细胞,发现EGCG剂量依赖性的抑制脂肪细胞分化。通过检测克隆增殖相关基因的表达,发现EGCG降低了 CCNA2和CDK2的蛋白和基因表达。进一步研究发现,EGCG降低FTO的蛋白表达,并提高CCNA2和CDK2 mRNA m6A水平,提示EGCG通过FTO-m6A途径调控CCNA2和CDK2的蛋白表达。同时发现,EGCG提高了 YTHDF2的基因和蛋白表达;超表达YTHDF2降低CCNA2和CDK2的mRNA稳定性。以上结果表明,EGCG通过靶向FTO阻滞克隆增殖过程,从而抑制脂肪细胞分化。综上所述,本研究揭示了 FTO以m6A去甲基化酶活性依赖的方式正调控猪前体脂肪细胞成脂分化;解析了 FTO通过JAK2-STAT3-C/EBPβ通路、克隆增殖和细胞自噬这三条途径促进猪脂肪细胞分化的分子机制;发现并阐明了 EGCG通过靶向FTO-m6A-YTHDF2途径抑制脂肪细胞分化的机制。本研究有助于我们更加深入理解猪脂肪细胞分化的生物学过程及其调控机制,为猪脂肪合理沉积的调控提供了有效的分子靶点,同时也为利用营养手段调控猪脂肪合理沉积奠定了理论基础。