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肌内脂肪(intramuscular fat,IMF)对肉类的品质有着重要的影响,适当增加肌内脂肪含量对改善肉类风味、嫩度以及可接受性有着重要作用。随着研究的不断深入,人们发现肌内脂肪主要存储在肌肉内的脂肪细胞中,至少80%的甘油三酯(triglycerides,TGs)储存在肌内脂肪细胞中。但是,仍有5%-20%的TGs以脂滴(lipid droplet,LDs)的形式直接储存在肌肉骨骼肌细胞中,对肌肉脂肪含量同样至关重要。黄豆苷元(7,4’-二羟基异黄酮,daidzein)是大豆异黄酮(soy isoflavone,SIF)的主要形式之一,是一种天然的植物雌激素,可以结合细胞内雌激素受体或直接刺激激活细胞内相关基因表达,发挥抗癌、抗高血压和抗神经元病变等功能,大量证据表明,大豆异黄酮可以调节动物的合成代谢,但是它们是否以及如何调节肌肉细胞的脂肪沉积仍需要进一步的研究。本研究所用细胞为体外培养的小鼠成肌细胞C2C12。向不含FBS的OPTI-MEMⅠ培养液培养的C2C12细胞中分别添加0,2.5,5,10,20和40μM的黄豆苷元,Western blotting结果发现,随着黄豆苷元浓度的逐渐增加,无活性的全长形式的SREBP-1c(full length form of SREBP-1c,f SREBP-1c)和成熟形式的SREBP-1c(the nuclear form of SREBP-1c,n SREBP-1c)蛋白表达水平逐渐增加,并且在黄豆苷元浓度为10μM时达到峰值,随后逐渐下降,表明黄豆苷元以剂量依赖的方式促进C2C12细胞SREBP-1c的表达与成熟。但是,TGs检测以及BODIPY染色发现黄豆苷元并没有影响C2C12细胞的TGs合成以及LDs形成。向C2C12细胞中分别添加0,0.3,0.6,1.2,2.4和4.8μM的脂肪酸(fatty acids,FAs),Western blotting结果表明,随着FAs浓度的逐渐增加,f SREBP-1c和n SREBP-1c蛋白表达水平逐渐增加,并且在FAs浓度为2.4μM时达到峰值,随后逐渐下降;TGs检测以及BODIPY染色同样发现随着FAs浓度的逐渐增加,C2C12细胞TGs合成以及LDs形成逐渐增加,并且在FAs浓度为2.4μM时达到峰值,随后逐渐下降,这些结果表明FAs可以促进C2C12细胞的脂肪沉积。向不含FBS的OPTI-MEMⅠ培养液培养的C2C12细胞中同时加入最适浓度的黄豆苷元和FAs,实验结果显示,与单独添加黄豆苷元或FAs相比,同时加入黄豆苷元和FAs后,C2C12细胞f SREBP-1c和n SREBP-1c蛋白表达水平、TGs合成和LDs形成明显增加,表明FAs是C2C12细胞脂肪合成的必需底物,黄豆苷元可以促进FAs依赖的C2C12细胞的脂肪沉积。为了探究黄豆苷元影响C2C12细胞脂肪沉积的分子机制,我们在添加黄豆苷元的同时使用PI3K-AKT信号通路抑制剂LY294002来抑制PI3K信号通路,Western blotting结果表明,添加黄豆苷元后,C2C12细胞p-AKT、p-NFκB1、f SREBP-1c和n SREBP-1c蛋白表达明显增加;而抑制了PI3K信号通路后,黄豆苷元促进p-PI3K、p-AKT、p-NFκB1、f SREBP-1c和n SREBP-1c蛋白表达的效应被大大降低,提示黄豆苷元是通过PI3K-AKT-NFκB1信号通路调节C2C12细胞SREBP-1c的表达与成熟的。荧光定量PCR实验结果表明,添加黄豆苷元后,SREBP-1c m RNA表达水平明显上升;染色质免疫共沉淀(CHIP-q PCR)实验结果表明,黄豆苷元可以促进p-NFκB1与SREBP-1c启动子区的结合,这些实验结果表明,黄豆苷元是通过PI3K-AKT-NFκB1信号途径影响C2C12细胞SREBP-1c的转录,从而调节C2C12细胞的脂肪沉积。为了进一步探究黄豆苷元对C2C12细胞脂肪沉积的调节作用是否依赖于雌激素受体(estrogen receptors,ERs),以激活PI3K信号通路。向C2C12细胞中添加黄豆苷元的同时抑制雌激素受体α(estrogen receptorα,ERα),Western blotting分析表明,单独添加黄豆苷元时,ERα蛋白表达没有变化;抑制ERα,不影响黄豆苷元对C2C12细胞SREBP-1c蛋白表达与成熟的促进作用,表明ERα不介导黄豆苷元对C2C12细胞脂肪沉积的调节作用。进一步实验观察了添加黄豆苷元同时抑制G蛋白偶联受体30(G protein coupled receptor 30,GPR30)的影响,Western blotting发现,单独添加黄豆苷元时,GPR30蛋白表达明显增加;抑制GPR30阻断了黄豆苷元促进C2C12细胞PI3K激活,NFκB1磷酸化,f SREBP-1c和n SREBP-1c蛋白表达增加的作用。Western blotting实验和免疫荧光实验发现,黄豆苷元以剂量依赖的方式促进C2C12细胞中GPR30蛋白的表达和细胞质定位,并在10μM时达到峰值,表明黄豆苷元依赖于GPR30介导以激活PI3K信号通路,进而调节C2C12细胞的脂肪沉积。综上所述,黄豆苷元以剂量依赖的方式促进C2C12成肌细胞中SREBP-1c的信号传导和脂肪酸依赖的脂肪沉积。黄豆苷元通过GPR30-PI3K-NFκB1信号通路促进SREBP-1c的转录。