目的:利用高保真聚合酶结合硫代磷酸化修饰的特异性检测引物构成的突变敏感性分子开关,建立能够准确、快速识别mt DNA 12S r RNA基因A1555G、C1494T、961del T三个与AAID密切相关的热点突变位点检测平台。通过该方法检测mt DNA 12S r RNA基因A1555G、C1494T、961del T三个突变位点的有无,来指导Am An的合理用药,预防AAID的发生。方法:以已构建好的同时包含mt DNA 12S r RNA基因A1555G、C1494T、961del T三个位点的突变型质粒和野生型质粒为模板,利用高保真聚合酶结合硫代磷酸化修饰的特异性检测引物构成的突变敏感性分子开关,对突变型质粒模板和野生型质粒模板分别进行引物延伸反应,将其PCR产物通过凝胶成像系统进行分析。通过调节PCR反应过程中退火温度、引物浓度、模板浓度等,优化PCR反应条件,然后在同一反应体系中对包含mt DNA 12S r RNA基因A1555G、C1494T、961del T三位点突变型质粒模板和野生型质粒模板进行PCR反应,并通过凝胶成像系统对其PCR产物进行分析。采用优化好的多重PCR反应条件和反应体系,确定所建立的检测平台的灵敏性。最后利用高保真酶介导突变敏感性分子开关对临床志愿者的血液基因组DNA样本进行基因突变的筛查。结果:在一定的反应体系和反应条件下,突变检测引物与野生模板不配对,无PCR产物,而与突变模板相配对,则有PCR产物。在优化PCR反应退火温度的过程中,随着退火温度的升高,突变敏感性分子开关的特异性提高。在不同的反应体系中,重组质粒经定量后,稀释成108、107、106、105、104、103、102、101拷贝/μL浓度梯度作为模板,然后再以稀释的质粒分别作为模板,本课题所构建的突变敏感性分子开关检测平台对于A1555G、C1494T的检测灵敏度达到103拷贝,特异性达到106拷贝,961del T的检测灵敏度达到102拷贝,特异性达到105拷贝,在同一反应体系的多重引物延伸反应中,对三位点突变进行同时检测,突变重组质粒经定量后,稀释成108、107、106、105、104、103、102、101拷贝/μL浓度梯度作为模板,本课题所构建的突变敏感分子开关检测平台对于三位点同时检测的灵敏度达到104拷贝。突变敏感性分子开关对50例临床志愿者mt DNA 12S r RNA基因A1555G、C1494T、961del T突变的筛查均没有发现A1555G、C1494T、961del T突变携带者。结论:利用突变敏感性分子开关技术,建立了快速筛查AAID相关的三热点突变的检测平台,从而对氨基糖苷类抗生素的临床用药进行指导,预防AAID的发生。