论文部分内容阅读
银纳米颗粒（AgNPs）具有不同的理化特性,在生物医学,工业和环境等领域有广阔的应用前景。因此,合成AgNPs的研究受到了学术界的高度关注。通常,合成AgNPs的途径主要包括化学,物理和最近的生物学技术。在这些技术中,生物合成技术与物理和化学合成技术相比,具有简单,可靠,经济且对环境友好的特点。AgNPs的生物合成技术充分利用了生物体系应对环境的能力。在重金属污染环境,存在顽强生存的细菌群落。这些细菌通过改变其适应环境的策略（尤其是其胞外蛋白的表达）而进化,从而在高度污染的条件下生存。鉴于其出色的生物相容性,两亲性以及与金属的相互作用,细菌的胞外蛋白（BEPs）可能是合成AgNPs的理想选择,可用于生物学和环境应用。在本论文研究工作中,我们开展了利用高度耐银细菌菌株及其胞外蛋白合成AgNPs的技术研究。我们研究了无细菌培养物提取物合成AgNPs的潜力,并通过响应面法优化了实验条件以增强AgNPs的合成。之后,研究了BEPs参与AgNPs合成的过程。确认BEPs参与后,我们对BEPs进行了粗提以将其用于AgNPs的形成。通过两种方法合成AgNPs后,我们对其进行了表征,并研究了将其用作针对抗生素抗性临床细菌病原体的有效抗菌剂。考虑到BEPs的重要性,我们优化了各种实验条件,如pH、孵育时间、碳和氮源以及AgNO3的初始浓度,以提高目标蛋白（ImpD,分子量～15.6 k Da）表达量。我们发现,向耐银细菌培养环境添加AgNO3可以提升目标蛋白ImpD的表达量。此后,我们制备了BEPs蛋白质样品,用于蛋白质结晶实验,以找出蛋白质结晶条件。最后,基于这些研究,开发了一种基于结晶技术的新方法,可直接从不纯的无细菌上清液中纯化目标细菌蛋白。主要工作包括:1无细菌上清液介导合成AgNPs:采用响应面方法（RSM）的2~3个全因子中心复合设计（CCD）进行工艺优化,以增强AgNPs的合成。AgNPs的合成工作中,我们研究了温度、pH、接种量和金属浓度等因素的单变量作用和多变量交互作用。pH、温度、无细胞培养上清液和金属浓度的最优化值分别为10、37℃、10%（v/v）和2m M。用紫外可见分光光度计检测合成的AgNPs,并用原子力显微镜（AFM）和透射电子显微镜（TEM）表征。形态上,AgNP呈椭圆形（宽20-240nm,长46-325nm）,球形（15-44 nm）,ζ电位为-41.3 m V。EDS,透射电镜（TEM）的电子衍射图谱和FTIR揭示了AgNPs的存在以及分别代表不同生物分子的氮、碳、氧、硫和官能团的特征。这些结果表明,生物分子特别是蛋白质参与了AgNPs的合成,因此可以用于生物学应用。此外,从合成的AgNPs分离到SDS凝胶上的蛋白质证实了有分子量大小约为～15.6 kDa的蛋白质封装了AgNPs。2使用BEPs粗提物合成AgNPs:通过透析去除了BEPs溶液中存在的小生物分子和盐,获得蛋白质的粗提物。之后,将该粗提物溶液用作还原剂以合成AgNPs。用紫外可见分光光度计鉴别合成的AgNPs,用Zetasizer Nano ZS测量粒度分布和ζ电位（ZP）。研究发现,AgNPs的平均尺寸和Zeta电位分别为58.75 nm和-26.9 mV。此外,通过使用原子力显微镜和高分辨率透射电子显微镜（HR-TEM）确定了AgNPs的大小和形态。此外,通过电子衍射谱和EDS谱证实了AgNPs与蛋白的包封。然后检查了这种生物途径制备的AgNPs对革兰氏阳性和革兰氏阴性抗生素耐药的临床细菌病原体的抗菌活性。结果表明AgNPs对测试的细菌病原体具有杀菌活性。3靶蛋白ImpD的过表达:我们发现,SMP1菌株分泌的蛋白ImpD具备高效制备AgNPs的能力,因此有必要提高该蛋白的表达量,以提高获得该蛋白的产率。为此,我们有必要对SMP1菌株的培养条件进行优化,以增加靶蛋白ImpD的表达量。优化研究中的因素包括细菌生长培养基的pH组成、AgNO3的初始浓度、AgNO3的添加时间和孵育时间。结果表明,添加蔗糖以及酵母提取物和胰蛋白作为碳和氮的来源,或者补充有AgNO3或不添加AgNO3,都会导致目标蛋白的过表达。其他优化条件包括pH值为6.5-7.0,AgNO3的初始浓度为25 mg/L,孵育温度为37℃,未添加AgNO3以及添加AgNO3的培养液中SMP1的孵育时间分别为24 h以及37-39 h。我们得出的结论是,对生长培养基进行加热灭菌后,添加经过过滤灭菌的AgNO3可以提高目标蛋白的产量。4通过结晶纯化目标蛋白质ImpD:我们利用SMP1菌株的无细胞上清液作为蛋白质溶液,除透析除去其中的小分子外,无需任何其他前处理,直接作为蛋白质样品用于蛋白质结晶条件筛选。筛选试验采用了10种不同的市售结晶试剂盒。经过多次结晶条件筛选试验后,选择了合适的结晶条件。结晶试验方法为坐滴法和悬滴法。另外,为了增加结晶成功率和足够大的晶体,采用了而一些促进结晶的途径,如使用分子印迹聚合物（MIP）、采用不同的结晶温度（4℃,20℃和30℃）,不同的pH值和不同的蛋白质浓度。通过Izit晶体染料,Xtal Light和X射线衍射等技术,可以将盐晶与蛋白质晶体区分开。最后,收集足量的蛋白质晶体,用以开展SDS-PAGE试验。研究结果表明,在凝胶上的蛋白条带与目标蛋白条带完全相同,约为～15.6 k Da,证明通过结晶获得纯化蛋白的途径是可行的。据此,我们得出结论,蛋白质结晶是直接从不纯样品中纯化蛋白质的一种有效途径。