研究背景肝纤维化(liver fibrosis)是机体对于各种因素引起的肝脏慢性损伤修复导致细胞外基质合成增多而降解减少,过度沉积在肝脏的病理过程,是严重的公共卫生问题。肝纤维化常可进展为肝硬化、肝癌并最终导致死亡。揭示肝纤维化的发病机制,阻断肝纤维化进展,对于防治肝硬化有着重要的意义。过去的研究认为肝星状细胞(hepatic stellate cells, HSC)在肝纤维化的发生中起着关键的作用。因此,对于肝纤维化机制和干预研究长期以来都聚焦在HSC上。然而,近年来越来越多研究表明,单核／巨噬细胞参与肝脏炎症和纤维化的发生、进展,在肝纤维化形成过程中起着更为关键的作用。巨噬细胞能够通过多种途径参与肝纤维化的发生,才是肝损伤和纤维化的中心调控者。肝损伤时肝组织巨噬细胞明显增多,除一部分来源于固有巨噬细胞的增殖外,更重要的是肝损伤时循环中的单核细胞能够被大量招募到损伤的肝组织,进一步分化为单核细胞来源的巨噬细胞,参与肝纤维化的发生和进展。单核细胞趋化蛋白1 (monocyte chemotactic protein 1, MCP-1)在肝组织内单核细胞浸润中起着关键的作用。MCP-1能通过作用外周血中的循环单核细胞表面的单核细胞趋化蛋白受体2(C-C chemokine receptor type 2, CCR-2),将外周血单核细胞招募到肝脏的炎症部位,演变为单核细胞来源的巨噬细胞参与肝脏损伤和纤维化。现有的研究已表明肝组织单核细胞来源的巨噬细胞在肝纤维化的发生中起着关键的作用,而MCP-1是单核细胞浸润重要的细胞因子,但这些研究主要来源于动物实验研究,在各种慢性肝病(chronic liver diseases, CLD)导致的肝纤维化患者中,肝组织巨噬细胞和外周血单核细胞浸润及MCP-1表达情况尚需要进一步研究证实。对于肝纤维化的治疗,尽管国内外进行了大量的研究,并取得一定的成果,但是几乎没有真正进入临床用于治疗肝纤维化的有效药物。鉴于MCP-1介导的单核细胞浸润在肝损伤和纤维化中的中心调控作用,通过抑制MCP-1进而减轻肝组织内单核细胞浸润已成为抗肝损伤和肝纤维化的新靶点。姜黄素(Curcumin)是一种从姜黄属姜黄、郁金、莪术等中药的根茎中提取的天然多酚类化合物。许多动物实验表明姜黄素具有较好的抗肝损伤和肝纤维化作用,但其作用机制尚不完全清楚。我们推测姜黄素能够通过抑制MCP-1减轻单核细胞来源的巨噬细胞肝脏浸润发挥抗肝损伤和纤维化的作用。本研究首先收集不同病因导致的CLD患者肝组织标本,采用免疫组织化学的方法对不同病因导致的CLD患者肝组织中单核细胞来源的巨噬细胞及MCP-1水平进行分析,以明确单核细胞来源的巨噬细胞及MCP-1表达与CLD患者肝纤维化的关系。进一步通过建立CCl4诱导的小鼠肝损伤和肝纤维化模型,验证单核细胞来源的巨噬细胞及MCP-1在肝损伤和纤维化中的作用,并观察姜黄素抗肝损伤和纤维化的作用,探讨姜黄素抑制MCP-1减轻单核细胞来源的巨噬细胞肝脏浸润抗肝损伤和纤维化的作用机理,为姜黄素的应用提供理论依据,同时为肝纤维化的治疗提供新的思路。方法第一部分 慢性肝病患者肝组织内单核细胞来源的巨噬细胞浸润研究收集93例CLD患者,包括慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)患者65例,原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis, PBC)患者7例,自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis, AIH)患者14例,酒精性肝病(alcoholic liver disease, ALD)患者7例及23例正常供肝组织石蜡标本,采用免疫组织化学方法检测CLD患者及正常对照肝组织中CD68+巨噬细胞和MAC387+单核细胞来源的巨噬细胞浸润情况及MCP-1表达。比较不同病因的CLD患者与正常对照组肝组织CD68+巨噬细胞和MAC387+单核细胞来源的巨噬细胞及MCP-1表达情况的差异及其与炎症分级和纤维化分期的关系。第二部分 姜黄素抑制单核细胞来源的巨噬细胞肝脏浸润抗小鼠急性肝损伤和肝纤维化作用1.姜黄素抑制单核细胞来源的巨噬细胞肝脏浸润抗小鼠急性肝损伤作用：C57BL/6小鼠单次腹腔注射CCl4建立急性肝损伤模型并给予姜黄素灌胃干预,检测各组小鼠血清谷丙转氨酶(alanine amiotransferase, ALT)和谷草转氨酶(aspartate aminotransferase, AST)水平；进行小鼠肝组织HE染色,评价姜黄素的抗急性肝损伤作用；流式细胞术检测小鼠肝组织内T细胞、树突状细胞(dendritic cells, DC)、自然杀伤(natural killer, NK)细胞及NKT细胞、单核细胞来源的巨噬细胞及其亚群比例。并采用抗CD45抗体、抗F4/80抗体、抗CD11b抗体进行免疫组织化学分析,检测各组小鼠肝组织内CD45+白细胞、F4/80+巨噬细胞、CD11b+单核细胞浸润情况。Real time PCR检测小鼠肝组织内炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA表达。Real time PCR及免疫组织化学法检测小鼠肝组织MCP-1的表达。2.姜黄素抑制单核细胞来源的巨噬细胞肝脏浸润抗小鼠肝纤维化作用：C57BL/6小鼠反复腹腔注射CC14,连续6周,建立肝纤维化模型,姜黄素灌胃给药,检测各组小鼠血清ALT和AST水平；小鼠肝组织HE染色、Masson染色,评价姜黄素的抗肝纤维化作用。流式细胞术检测小鼠肝组织中T细胞、DC细胞、NK细胞及NKT细胞、单核细胞来源的巨噬细胞及其亚群比例。并采用免疫组织化学方法检测各组小鼠肝组织内CD45+白细胞、F4/80+巨噬细胞、CD11b+单核细胞浸润情况。Real time PCR检测小鼠肝组织内TNF-α、IL-6、 IL-1β、TGF-β1 mRNA表达。Real time PCR及免疫组织化学法检测小鼠肝组织MCP-1的表达。免疫组织化学检测小鼠肝组织内α-SMA表达,探讨姜黄素对HSC活化的影响。结果第一部分慢性肝病患者肝组织内单核细胞来源的巨噬细胞浸润研究1. CHB、PBC、AIH及ALD患者肝组织内CD68+巨噬细胞均较正常对照肝组织明显增多。而不同病因所导致的CLD患者之间,CD68+巨噬细胞数量无明显的统计学差异。随着炎症(G)分级的增高,CLD患者肝组织内CD68+巨噬细胞比例明显增高。不同纤维化分期的CLD患者,肝组织内CD68+巨噬细胞的数量均较正常对照组明显增多,但不同纤维化(S)分期的CLD患者之间无明显统计学差异。CLD患者肝组织内CD68+巨噬细胞数量与CLD患者ALT、AST、GGT、 Tbil水平及Child-Pugh评分均呈明显的正相关,与Alb等水平无明显的相关性。2.CHB、PBC、AIH及ALD患者肝组织内MAC387+单核细胞来源的巨噬细胞均较正常对照肝组织明显增多,而不同病因CLD患者肝组织内MAC387+单核细胞来源的巨噬细胞无明显统计学差异。不同G分级的CLD患者肝组织内MAC387+单核细胞来源的巨噬细胞数量均较正常对照组增高,G4级CLD患者肝组织内MAC387+单核细胞来源的巨噬细胞数量明显高于G1、G2及G3级的患者。不同纤维化分期的CLD患者,肝组织内MAC387+单核细胞来源的巨噬细胞数量均较正常对照组明显增多,而S4期患者MAC387+单核细胞来源的巨噬细胞数量又明显高于S0-1、S2及S3期CLD患者。CLD患者肝组织内MAC387+单核细胞来源的巨噬细胞数量与CLD患者ALT、AST、GGT、Tbil水平及Child-Pugh评分均无明显的相关性,而与Alb呈负相关,与CRP水平呈正相关。3.正常对照肝组织,仅有很少量MCP-1表达,而CLD患者肝组织内可见大量MCP-1表达。CLD患者肝组织内MCP-1评分较正常对照组明显增高。CHB、PBC、AIH及ALD肝组织内MCP-1评分均较正常对照组肝组织明显增高,而CHB和ALD患者肝组织内MCP-1评分略高于PBC和AIH患者。与MAC387+单核细胞来源的巨噬细胞一致,不同G分级的CLD患者肝组织内MCP-1表达均较正常对照组增高,G4级CLD患者肝组织内MCP-1表达亦高于G2和G3级的患者。不同纤维化分期的CLD患者,肝组织内MCP-1评分均较正常对照组明显增高,而S4期患者MCP-1评分又明显高于S0-1、S2及S3期CLD患者。相关性分析发现MCP-1表达与CD68+巨噬细胞及MAC387+单核细胞来源的巨噬细胞数量均呈明显的正相关。第二部分姜黄素抑制单核细胞来源的巨噬细胞肝脏浸润抗小鼠急性肝损伤和肝纤维化作用1.姜黄素抑制单核细胞来源的巨噬细胞肝脏浸润抗小鼠急性肝损伤作用：CC14单次注射可以显著造成小鼠急性肝损伤,表现为CC14注射48 h后小鼠血清ALT、AST水平较正常组明显增高；肝组织HE染色示,CC14注射后小鼠肝组织肝细胞大量坏死,并伴有炎症细胞浸润。姜黄素治疗并不能显著减低小鼠血清ALT、AST水平,但可以明显减轻小鼠肝细胞损伤和炎症细胞浸润。CC14单次腹腔注射后,小鼠肝组织单核细胞来源的巨噬细胞比例较正常对照组明显增加,而增加的单核细胞来源的巨噬细胞主要为Grlhi单核细胞来源的巨噬细胞。而其他细胞如T细胞、DC细胞、NK细胞及NKT细胞变化不明显。姜黄素能够明显抑制单核细胞来源的巨噬细胞的浸润,能抑制Grlhi单核细胞来源的巨噬细胞。免疫组化分析示模型组肝组织内CD45+白细胞、F4/80+巨噬细胞、CD11b+单核细胞较正常对照组明显增加,而姜黄素组可以明显减少这些细胞的浸润。CCl4注射48 h后小鼠肝组织炎症因子TNF-α、IL-6较正常对照组明显增高,IL-1β亦有增高的趋势。姜黄素组小鼠肝组织内TNF-α、IL-6、IL-1β较模型组并无明显降低。Real time PCR检测各组小鼠肝组织MCP-1的mRNA表达水平,发现模型组小鼠肝组织内MCP-1表达水平较正常对照组明显升高。而姜黄素组小鼠肝组织内MCP-1 mRNA水平亦明显高于正常对照组,但较模型组无明显降低。进一步对小鼠肝组织采用MCP-1抗体进行免疫组化分析,结果发现模型组肝组织内MCP-1表达明显较正常对照组增强,而姜黄素组小鼠肝组织MCP-1染色明显弱于模型组。2.姜黄素抑制单核细胞来源的巨噬细胞肝脏浸润抗小鼠肝纤维化作用：CC14反复注射可以显著造成小鼠肝纤维化,表现为小鼠血清ALT、AST水平较正常组明显增高；肝组织HE染色示,肝细胞大量坏死,小叶结构紊乱,并伴有炎症细胞浸润；Masson染色示小鼠肝组织内胶原纤维较正常对照组明显增多,肝小叶纤维间隔形成。姜黄素治疗能显著减低小鼠血清ALT、AST水平,明显减轻小鼠肝细胞损伤和炎症细胞浸润,减轻肝组织纤维增生。CC14反复腹腔注射后,模型组小鼠肝组织单核细胞来源的巨噬细胞比例较正常对照组明显增加,而增加的单核细胞来源的巨噬细胞主要为Gr1hi单核细胞来源的巨噬细胞。模型组CD3+T细胞比例及DC细胞比例明显高于正常对照组,而NK及NKT细胞比例明显低于正常对照组。而姜黄素对T细胞、DC细胞、NK细胞及NKT细胞无明显影响。但姜黄素能够明显抑制单核细胞来源的巨噬细胞的浸润,主要以抑制Grlhi单核细胞来源的巨噬细胞亚群为主。免疫组化分析示模型组小鼠肝组织内CD45+白细胞、F4/80+巨噬细胞、CD11b+单核细胞较正常对照组明显增加,而姜黄素可以明显减少这些细胞的浸润。CCl4注射6周后模型组小鼠TNF-α水平较正常对照组明显增高,IL-1β、IL-6 mRNA水平亦呈增高趋势,而姜黄素能明显降低肝组织内促炎因子TNF-a mRNA表达。模型组小鼠肝组织内TGF-β1、 mRNA水平较正常对照组明显增高,而姜黄素干预后小鼠肝组织内TGF-β1 mRNA水平较模型组明显降低。Real time PCR及免疫组织化学检测各组小鼠肝组织MCP-1的表达水平,结果提示模型组小鼠肝组织内MCP-1表达水平较正常对照组明显升高。而姜黄素能明显降低小鼠肝组织内MCP-1表达水平。小鼠肝组织MCP-1免疫组化也有同样发现。此外,α-SMA免疫组化还表明,姜黄素能明显抑制α-SMA表达,提示其能抑制HSC的活化。结论1.不同病因的CLD患者肝组织内巨噬细胞及单核细胞来源的巨噬细胞明显增多且与肝脏的炎症程度和纤维化程度相关；MCP-1可能介导了CLD患者肝组织内的单核细胞浸润；2.姜黄素具有抗急性肝损伤和肝纤维化的作用,其抗急性肝损伤和肝纤维化的作用机制可能与其抑制肝组织内MCP-1表达进一步抑制Grlhi单核细胞来源巨噬细胞肝脏浸润有关。