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细胞质雄性不育(Cytoplasmic male sterility, CMS)是一种由细胞质基因控制的花粉败育类型,在高等植物中相当普遍。CMS作为植物杂种优势利用的核心技术,已被广泛应用于杂交种子生产,对世界粮食增产及安全具有非常重要的意义。目前,研究者已经找到大量CMS相关基因,其中一部分通过转基因的方法得到验证,但是我们对CMS蛋白的作用机理仍然知之甚少。水稻红莲型CMS是我国有代表性的细胞质雄性不育类型之一,被广泛应用于三系杂交水稻生产,在全国已经累计推广上亿亩。红莲型水稻的CMS基因orfH79已被克隆,并且通过转基因得到验证,但ORFH79蛋白在不育系线粒体中的结构和功能仍然未知,并且ORFH79蛋白诱导花粉败育的代谢路径也不十分清楚。本研究中,我们采用差速离心配合Percoll梯度离心技术,从不育系粤泰A(Yuetai A, YtA)及其保持系粤泰B (Yuetai B, YtB)黄化苗中纯化得到线粒体。利用双甲基化标签质谱定量技术,比较研究了二者线粒体总蛋白质组的差异。并且配合蓝绿胶电泳技术(Blue native polyacrylamide gel electrophoresis, BN-PAGE)及2D BN/Tricine-SDS PAGE.比较研究了线粒体蛋白质复合体亚基组成和含量的差异。线粒体蛋白质组学分析共鉴定得到216个水稻线粒体蛋白,其中208个蛋白为线粒体总蛋白,91个蛋白为参与复合体组装的蛋白,83个蛋白同时包含上述二者定量信息。216个线粒体蛋白依功能可分为12类,覆盖绝大部分线粒体功能。肽段数目和BN组分关联分析显示参与同一复合体组装的亚基在BN胶中呈现聚合效应,说明BN胶内蛋白定量信息能间接反映复合体定量信息。深入分析不育系和可育系线粒体总蛋白与复合体的定量信息,我们发现不育系线粒体内大部分蛋白的总含量上升,这些蛋白实际参与复合体组装的含量却低于可育系,其中负责氧化磷酸化的复合体Ⅰ和复合体V表现得尤为典型,说明不育系中复合体组装过程存在缺陷。不育系线粒体中大量氧自由基(Reactive oxygen species,ROS)及胁迫响应相关蛋白普遍上调,从蛋白水平应证了不育系受到严重的氧化胁迫,我们认为氧化胁迫导致不育系中线粒体蛋白氧化受损,进而影响复合体组装。线粒体总蛋白质组学分析发现,大部分线粒体蛋白变化在2倍以内,然而有4个蛋白在不育系中上调2倍以上,其中2个为花穗性决定类似蛋白(sex determination TASSELSEED2like protein, TS2)(Os07g46920.1, Os07g40250.1),它们上调达到4到6倍。参考玉米中TS2的研究结果,我们认为TS2家族与茉莉酸代谢息息相关。定量分析红莲型水稻黄化苗、绿苗和稻穗中茉莉酸代谢相关物质的含量,发现不育系中茉莉酸的代谢前体13-羟基十八碳三烯酸(Hydroxy octadecatrienoic acid,13-HOTE)和cis-(+)-12-oxophytodienoic acid (OPDA)在苗期显著上调,在减数分裂、四分体、单核和二核时期的稻穗中也呈现急剧的升降变化,说明茉莉酸代谢在不育系水稻发育的各时期均存在异常,这一发现为阐明CMS机理提供了一条非常新颖的线索。以重组表达的ORFH79蛋白(不含N端与COX1同源的序列)为免疫原,得到抗ORFH79血清。用非离子去垢剂月桂酰基麦芽糖苷处理线粒体蛋白,Western-blot检测发现膜蛋白ORFH79可以完全被其溶解。通过2DBN/Tricine-SDS PAGE及其VVestern-blot,发现ORFH79至少参与5个复合体的组装,这些复合体大小范围在400kDa到1.2MDa之间,说明ORFH79在不育系中以复合体的形式发挥作用。结合线粒体蛋白质组学和免疫共沉淀分析结果,我们认为ORFH79可能参与复合体V的Fo亚复合体或者某些未知功能复合体的组装。