论文部分内容阅读
花色是观赏植物最重要的观赏性状和经济性状之一。蓝色给人高雅和梦幻般的感觉,但世界四大鲜切花都缺少蓝色系列,因此培育蓝色花卉已成为近十多年来花卉育种中花色研究和改良的热点之一。类黄酮-3’,5’-羟基化酶(flavonoid-3’,5’-hydroxylase,F3’5’H)是飞燕草色素合成过程中的关键酶,月季、康乃馨、百合等很多观赏植物缺少蓝色系,主要原因就是不含或者只含有很少量的F3’5’H。世界上许多国家已从多种植物中分离到了蓝色花色相关基因,其中有的已用于蓝色花色的改良和育种工作,转基因蓝色月季的成功入市使得蓝色花色基因工程得到了普遍关注。相比之下,我国起步较晚,但我国拥有丰富的蓝色花色资源,可用于蓝色花色基因的开发和利用。本研究以川乌头、昆明乌头和中国桔梗为试材,克隆了F3’5’H基因cDNA全长序列。并研究了F3’5’H基因的时空表达模式,主要研究结果如下：1.根据已知基因的保守序列设计简并引物,采用RT-PCR和RACE相结合的方法,从川乌头和中国桔梗花朵中克隆了F3’5’H基因片段并获得cDNA全长序列,分别命名为Ac-F3’5’H (GenBank登录号：JN635708)和Pg-F3’5’H (GenBank登录号：JQ403611)。利用Ac-F3’5’H基因全长扩增引物,从昆明乌头中分离得到了F3’5’H基因cDNA全长序列,命名为Av-F3’5’H (GenBank登录号：JQ806761)。2.序列分析表明,这3个基因编码的氨基酸序列与其他同源序列相似度很高,属于P450基因家族(CYP450),均包含CYP基序、Ⅰ螺旋区和血红素结合区等结构域。同源性比较以及系统进化树分析表明：Av-F3’5’H基因和AC-F3’5’H基因氨基酸同源性高达95％;Ac-F3’5’H基因与翠雀中的F3’5’H有88%的相似度；Pg-F3’5’H基因与风铃草中的F3’5’H有80%的相似度。这3个基因的系统进化基本符合植物分类学分类。3.采用半定量RT-PCR的方法,分析了3个F3’5’H基因在花朵不同发育时期以及根、茎、叶、花不同组织器官的表达模式。结果显示这3个F3’5’H基因随花朵发育表达量都呈现先增后减的趋势,且Ac-F3’5’H基因和Pg-F3’5’H基因均在其花朵发育第4时期表达最显著,Av-F3’5’H基因在其花朵发育第3时期表达最显著。3个F3’5’H基因在其根、茎、叶中不表达,说明该基因是花器官特异性表达基因,并受花朵生长发育调控。推测其可能在调节蓝色花朵形成中发挥作用。4.成功构建了川乌头F3’5’H基因的植物表达载体pCAMBIA1301-220.6-Ac-F3’5’H。