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环境宏基因组文库的构建是开发未培养微生物资源的有效途径。本研究通过构建湖羊瘤胃未培养微生物的宏基因组文库,共获得12,000个克隆,文库外源DNA总容量为3.6×108 bp,筛选得到2个表达内切-1,4-β-木聚糖酶活性的克隆。选择其中表达木聚糖酶活性较强的克隆UMXYL2作为进一步研究的对象。通过亚克隆及测序得到3个木聚糖酶基因UMXYL2-1-1、UMXYL2-1-2和UMXYL2-6-1,分析结果表明都是新的木聚糖酶基因,为进一步研究木聚糖酶的降解机理及构建能降解各种不同饲料来源木聚糖的酶库打下基础。
UMXYL2-1-1基因由1086个核苷酸组成,(G+C)含量为53.78%,熔点为86.49℃,可编码一个含361个氨基酸的蛋白质,蛋白预计分子量为38,974.2道尔顿,等电点pI为8.56。UMXYL2-1-2基因由849个核苷酸组成,(G+C)含量为52.41%,熔点为85.80℃,可编码一个含282个氨基酸的蛋白质,蛋白预计分子量为31,039.2道尔顿,等电点pI为8.52。UMXYL2-6-1基因由1278个核苷酸组成,(G+C)含量为50.23%,熔点为85.11℃,可编码一个含425个氨基酸的蛋白质,蛋白预计分子量为45,777.8道尔顿,等电点pI为8.72。
UMXYL2-1-1、UMXYL2-1-2和UMXYL2-6-1蛋白均为来自糖基水解酶家族11的木聚糖酶,编码产物都与产琥珀酸丝状杆菌Fibrobacter succinogenes(accession no.AAA21848.1)的内切-1,4-β-木聚糖酶同源性最高,UMXYL2-1-1的编码产物与其有67%的相似性,UMXYL2-1-2的编码产物与其有45%的相似性,UMXYL2-6-1的编码产物与其有62%的相似性,它们可能有着共同的来源。氨基酸序列比较发现三条序列中间部分相似度非常高,推测该区域可能为蛋白的活性中心;并且UMXYL2-1-1、UMXYL2-1-2来自同一个阳性亚克隆UMXYL2-1,间隔仅为205bp,推测该木聚糖酶基因可能是以基因簇的形式存在的。系统进化分析也表明UMXYL2-1-1、UMXYL2-1-2和UMXYL2-6-1可能都是来自产琥珀酸丝状杆菌或丝状杆菌属一个未培养的种。
PCR扩增木聚糖酶基因并连接到表达载体pET28a(+)上,将UMXYL2-1-1和UMXYL2-1-2基因分别在BL21中实现了表达。对UMXYL2-1-2蛋白的表达条件和酶学特性做了初步研究,结果表明:在25℃条件下诱导最佳,UMXYL2-1-2蛋白的最适pH值在4.5左右,最适温度在40℃左右,最适条件下测定木聚糖酶酶活为24.63 u/mL。