穴居狼蛛[Lycosa singoriensis]是一种剧毒蜘蛛。在国内主要分布在新疆、甘肃、内蒙古、吉林等省区。它的粗毒中含有多种抑制细菌生长与繁殖的物质。随着对狼蛛粗毒的研究深入,得到了四种序列相似性极高的多肽。分别命名为lycosin-Ⅰ; lycosin-Ⅱ;lycosin-Ⅲ和lycosinⅣ,分别含有23；22；21和19个氨基酸残基。初步研究表明lycosinⅡ和lycosinⅣ对k562细胞毒性较弱。lycosin-Ⅰ和lycosin-Ⅲ对癌细胞K562的EC5o分别为7.4ug/ml、和26.2ug/ml。基于以上的研究背景,本实验通过固相化学合成的方法得到L型lycosinⅠ,lycosinⅡ,lycosinⅢ,lycosinⅣ四种多肽粗品,经制备型HPLC纯化得到其纯品,maldi-tof MS鉴定其分子量与狼蛛粗毒中得到的相应天然多肽分子量一致,各样品在质谱上的纯度大于90%。随后分别开展各四种多肽对K562细胞的细胞毒性实验,并通过DNA Ladder检测进一步确定各四种多肽是否诱导K562细胞发生凋亡。通过监测细胞内钙荧光变化探索各四种多肽诱导凋亡是否与细胞内自由钙离子浓度具有相关性。通过流式细胞术监测不同浓度各四种多肽诱导K562细胞发生凋亡及早晚期凋亡的比例。为了确认凋亡是否与CASPASE通路即线粒体凋亡途径相关,本实验进一步研究了CASPASE3的直接下游底物PARP是否发生相应的剪切。实验结果表明在较高浓度下(大于等于120ug/ml),各四种多肽对K562细胞都表现出生长抑制作用。而在低浓度下,只有LycosinⅠ和lycosinⅢ对K562细胞表现出毒性。lycosin Ⅰ对K562细胞的ECso为7.4ug/ml,而lycosinⅢ对K562细胞ECso为26.2ug/ml。DNA Ladder检测也更一步证明lycosinⅠ和lycosinⅢ在较低浓度下即可诱导K562细胞发生了凋亡,而lycosinⅡ在浓度大于60ug/ml时亦可观察到基因组DNA片段化现象。相反的,lycosinⅣ在浓度大于120ug/ml时尚观察不到DNA片段化。细胞内自由钙离子荧光实验证明lycosinⅠ和lycosinⅢ诱导K562细胞发生凋亡与细胞内自由钙离子浓度上升相关。流式细胞术表明用不同浓度lycosinⅠ和lycosinⅢ处理K562细胞24h后,可以观察到明显的早期和晚期凋亡现象。PARP剪切实验表明各四种多肽均不能诱导caspase3的直接下游底物PARP蛋白发生剪切,暗示lycosinⅠ和lycosinⅢ诱导的K562细胞凋亡可能与线粒体途径的细胞凋亡无关,而可能与其它两条凋亡途径如死亡受体途径或者内质网凋亡通路相关。