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曲霉类丝状真菌是优良的蛋白表达宿主和重要的工业生产菌种,在基础研究和工业生产中具有广泛的应用。对丝状真菌曲霉的基因工程研究日益活跃,而其遗传转化系统是进行基因工程研究必不可少的手段。本研究对曲霉菌的转化系统进行探索,以工业上具有重要应用的黑曲霉酸性蛋白酶PepA为例,利用农杆菌介导的转化方法(Agrobacterium-mediated transformation, AMT)研究了泡盛曲霉(Aspergillus awamori)CBS115.52的转化,获得了能分泌表达黑曲霉酸性蛋白酶PepA的重组泡盛曲霉转化子。同时通过将黑曲霉酸性蛋白酶PepA运用原生质体PEG-CaCl2转化法和农杆菌介导转化方法对米曲霉(Aspergillus oryzae) AS3.951的遗传转化进行了探索。经潮霉素B(hygromycin B)抑制作用实验,确定潮霉素抗性基因作为泡盛曲霉遗传转化的筛选标记。通过Gateway技术,利用本实验室已构建的黑曲霉酸性蛋白酶表达盒元件的各入门克隆和pHGW载体,构建了用于农杆菌转化的双元载体pHGW-aPA。利用pHGW-aPA,通过农杆菌介导进行泡盛曲霉CBS115.52的转化,PCR实验及测序表明黑曲霉酸性蛋白酶PepA通过AMT方法被成功转化到泡盛曲霉CBS115.52中。荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR, qPCR)及Western blotting技术,从转录和翻译水平证明泡盛曲霉CBS115.52转化子能够分泌表达黑曲霉酸性蛋白酶PepA。在泡盛曲霉转化的基础上,本研究对米曲霉的转化进行了探索。通过辅剂氯丙嗪(chlopromazine)的方法使米曲霉AS3.951对潮霉素B的敏感性提高:在添加200mg/ml (核实一下,有这么大的浓度吗,200g/L)的潮霉素和0.1mM氯丙嗪的CD培养基中米曲霉的生长即可被很好的抑制。因此,以潮霉素抗性作为农杆菌介导米曲霉AS3.951转化的筛选标记。PepA转化米曲霉AS3.951后,通过PCR证实利用农杆菌可以实现米曲霉AS3.951的转化。同时,研究了吡啶硫胺素(pyrithiamine,PT)对米曲霉AS3.951的抑制作用,结果表明在CD培养基中添加0.1μg/mL的PT会完全抑制米曲霉AS3.951的生长,因此PT抗性基因ptrA可以作为米曲霉转化的筛选标记。采用原生质体转化方法,以PepA的表达质粒为例,分共转化、环状质粒转化及线性质粒转化等方式对米曲霉AS3.951的转化进行了探索。