研究背景:迁移活动(Migration)是活细胞普遍存在的一种运动方式。血管内皮细胞(ECs)的迁移在血管生理、病理活动中扮演极为重要的角色。临床观察证明，血管外科手术后的伤口愈合、内皮损伤区的再内皮细胞化(Reendothelization)都伴随着内皮细胞向伤口处的迁移。内皮细胞迁移在血管重建(Remodeling)过程中起着重要作用。例如组织再生过程中的血管生成(Angiogensis)，血管旁路移植、气囊血管形成术(Balloon angioplasty)后的伤口愈合都必须有内皮细胞从邻近部位迁移到损伤部位。而在一些慢性疾病，如癌症、动脉粥样硬化和慢性炎症纤维化等也常伴有特定的细胞迁移。恶性肿瘤侵袭周围组织的过程中，也常常伴随着血管内皮细胞的迁移，在肿瘤实体中形成丰富的新生血管来对肿瘤细胞增殖提供足够营养。血管新生是在生理或者病理情况下，在原有血管基础上通过血管内皮细胞的迁移和增殖，从先前存在的血管处以芽生或者非芽生的形式形成新的血管的过程，该过程主要分为血管内皮细胞增殖、迁移、管腔形成三个步骤。其中，血管内皮细胞的迁移是血管新生过程中关键环节。在生理、病理过程中促使血管内皮细胞迁移的诱导因素有很多。IL-8是1987年由Yoshimura等首次从脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)及植物血凝素(Phytohaemagglutinin，PHA)刺激的人血单核细胞培养上清中纯化出的一种CXC家族趋化因子<'[5]>，主要是由单核．吞噬细胞和内皮细胞产生，是很多诱导炎性细胞趋化性活动中非常重要的一种信号分子，参与多种非特异性炎症的病理发生过程。近期的研究发现，在动脉粥样硬化或内皮细胞损伤部位都有IL-8的高表达，IL-8也能够激活内皮细胞，因此认为IL-8参与了动脉粥样硬化的发生发展全过程，在这当中起着介导内皮细胞迁移的作用。 近年来，细胞迁移的信号转导研究逐渐成为热点。许多学者的研究发现，细胞迁移的主要过程为细胞外部信号引起细胞的极化，从而使细胞沿移动方向形成突触，细胞的突触与基底形成黏附，这些黏附作为细胞收缩的支点，当细胞收缩时细胞整体向前移动，细胞尾部与基底的黏附点得以释放。而这一过程中主要涉及到细胞骨架和细胞黏附相关的动态组装和空间位置的改变。小G蛋白RhoA家族是肌动蛋白细胞骨架重新组装的主要调节因子之一，因此在协调细胞迁移中起着重要作用。此外，在对整合素信号通路研究中发现，基质不断提供信号给迁移细胞的RhoA蛋白，从而影响细胞迁移。另有研究表明，长期抑制RhoA激酶活力可以诱导冠状动脉粥样硬化斑块的消退。由此可见，RhoA蛋白可能是介导IL-8诱导的内皮细胞迁移中的关键分子之一。 本研究的目的在于探讨IL-8这一趋化性细胞因子诱导内皮细胞迁移的机理，并在前期实验的基础上进一步观察RhoA蛋白对于内皮细胞迁移的作用，以期揭示恶性肿瘤血管新生的相关细胞分子机制，为恶性肿瘤的诊断与防治提供新思路。 研究方法:选用本实验室保存的内皮细胞株EA.hy 926作为靶细胞，研究方法如下： 1．选用浓度为0、50ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml的IL-8分别加入Transwell小室下层，诱导上层的内皮细胞迁移，4h后，对迁移至下层的内皮细胞进行计数及统计学分析，以选择最适的IL-8浓度，为后期实验提供准备。 2．采用脂质体包绕法将RhoA野生型、主导抑制型RhoA188A和稳定表达持续活化型RhoA63L突变型质粒转染进入血管内皮细胞后，使用G418稳定筛选得到稳定表达的细胞株。 3．对稳定转染的细胞株进行分析，RT-PCR检查其mRNA，Western-blot检查蛋白翻译情况，Pull-down检查活性蛋白表达情况。 4．实验分为4组：RhoAwt组、RhoA188A组、RhoA63L组和对照组加入Transwell小室上层，下层加入IL-8，在4h后，对迁移至下层的内皮细胞进行计数及统计学分析。 结果: 1．当IL-8浓度为100 ng/ml时内皮细胞迁移率最大，因此我们将选择100 ng/ml的IL-8进行实验。 2．培养稳定转染细胞株：RhoAwt、RhoA188A、RhoA63L成功。 3．对于转染情况的检查，RT-PCR检查其mRNA，Western-blot检查蛋白翻译情况，Pull-down检查活性蛋白表达情况均获得理想结果。 4．在IL-8刺激下，EA．hy926-Rh063L组细胞迁移能力远较对照组高，而EA.hy926-Rh0188A组细胞迁移能力则被明显抑制。 结论: 1．IL-8作为一种新型的细胞趋化因子，不仅能够诱导炎性细胞迁移，也能够有效诱导血管内皮细胞迁移。当IL-8浓度为100ng/ml时，对于内皮细胞迁移率提高最大，因此我们在后续实验当中选用这个IL-8浓度。 2．Rhoh蛋白作为小G蛋白家族成员之一，能够对于细胞迁移的过程起决定性作用，在活性RhoA蛋白表达上调的情况下，细胞迁移率增高。