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研究背景牙周炎（periodontitis）是导致成年人牙齿脱落常见的疾病,是一种由局部因素（菌斑、牙石、创伤性咬合等）引起的,发生于牙周支持组织的慢性破坏性疾病。牙周炎主要临床表现为牙周袋形成、附着丧失、牙槽骨的吸收破坏。牙周炎好发于35岁以上成年人,患病率高,与全身健康密切相关,目前临床上对牙周炎的治疗方式多为对症治疗,旨在祛除感染因素,控制炎症发展,但已经丧失的牙周支持组织,无法再生。因此研究牙周组织再生,尤其是牙槽骨的再生机制对于牙周炎的治疗具有重要的意义。牙周膜干细胞（Periodontal ligament stem cell,PDLSCs）是一种间充质来源的成体干细胞,具有分化成牙槽骨细胞、牙周膜细胞和牙骨质细胞的潜能,正常生理条件下细胞处于静息状态,参与维持牙周组织中细胞功能稳态。当牙周疾病导致牙周组织中细胞生理功能紊乱或细胞受损时,处于不同分化阶段的干细胞会被激活,修复重建受损的牙周组织;因此,PDLSCs的分化能力被认为是牙周组织修复和再生的重要细胞学基础。近年来随着干细胞技术研究的不断深入,基于PDLSCs的组织工程、细胞治疗和基因工程技术为牙周组织缺损的再生治疗带来新的方向。ETS原癌基因2（ETS Proto-Oncogene 2,ETS2）是ETS转录因子家族最重要的成员,位于人类21号染色体,其编码的蛋白是一种Ca2+依赖性磷酸化蛋白,参与调节细胞的增殖、分化、凋亡等生理和病理过程。目前有关ETS家族的研究大部分和肿瘤的发生发展有关,但也有研究发现,ETS家族蛋白亦可以参与调节软骨和骨的形成过程。本研究使用成人健康牙周膜分离培养出原代hPDLSCs;检测hPDLSCs体外成骨分化过程中ETS2和成骨相关基因的表达;最后通过调控ETS2的表达,检测hPDLSCs成骨分化能力以及成骨基因表达变化,明确ETS2对hPDLSCs成骨分化的作用,为调控hPDLSCs成骨分化提供新的靶点。方法1.通过组织块联合酶消化法从成人健康恒牙分离牙周膜细胞,显微镜下观察细胞形态,有限稀释法纯化细胞;2.流式细胞术检测间充质干细胞表面标记物,三系分化诱导检测其多向分化能力;3.将hPDLSCs随机分为对照组和成骨组,在不同时间节点（3、7、14d）,QPCR检测ETS2、ALP、BMP2、OCN、OPN、RUNX2表达情况;4.将hPDLSCs随机分为对照组（未转染）、GFP组（LV-GFP转染）、shETS2组（LV-shETS2转染）,成骨诱导72小时后,Western blot和QPCR检测基因及蛋白表达情况;5.成骨诱导14d后,茜素红染色,扫描拍照后,10%氯化十六烷吡啶溶解后540nm测OD值。结果1.组织块联合酶消化法获得了牙周膜细胞,通过有限稀释法克隆提纯得到了纯化的hPDLSCs;2.流式细胞术检测间充质干细胞表面标记物CD44、CD29表达阳性,造血干细胞表面标记物CD34、CD45表达阴性,表明原代培养获得的细胞为MSC来源;成骨诱导茜素红染色可见大量红色矿化结节形成,成脂诱导油红O染色见大量胞内脂滴形成,成软骨诱导苏木精和阿利新蓝染色见胞核被染成紫色,细胞外粘多糖被染成蓝色;3.hPDLSCs体外成骨分化过程中,成骨组ETS2 mRNA在3 d、7 d、14 d较对照组表达增加（P<0.05）;ALP、BMP2、RUNX2 mRNA在7 d、14 d时表达较对照组明显增加（P<0.05）;OCN、OPN mRNA在14 d表达较对照组明显增加（P<0.05）;4.LV-shETS2转染细胞后,shETS2组OCN、OPN、ALP mRNA、蛋白表达较GFP组降低（P<0.05）;5.LV-shETS2转染细胞后,成骨诱导14d,shETS2组细胞成骨分化能力较GFP组降低（P<0.05）。结论1.本试验利用组织块酶消化法、有限稀释法分离纯化得到人牙周膜干细胞,并通过流式细胞术鉴定细胞为MSC来源,同时具有良好的成骨、成脂、成软骨分化能力;2.hPDLSCs体外成骨分化过程中,ETS2及ALP、BMP2、OPN、OCN、RUNX2表达增加;3.LV-shETS2转染细胞后,hPDLSCs成骨分化能力降低,成骨基因ALP、OPN、OCN表达降低;证实ETS2可干扰人牙周膜干细胞成骨分化。