[研究背景及目的]：　　 肝纤维化(hepaticfibrosis，HF)是指肝细胞发生坏死时，活化的成纤维细胞或肌成纤维细胞增多，肝脏中胶原蛋白等细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)的增生与降解失衡，导致肝脏内纤维结缔组织大量沉积的病理改变。它是继发于各种慢性肝损伤之后的组织修复过程，重者可转化为肝硬化。肝纤维化具有可逆性，阻断或延缓肝纤维化的发生发展，对于多种慢性肝病的治疗具有重要的应用价值。　　 肝星状细胞(hepaticstellatecells，HSCs)在肝纤维化过程中起主要作用，是ECM的主要来源。在肝损伤过程中，HSCs受各种细胞因子的调控发生表型转变，获得肌成纤维细胞(myofibroblast，MFb)特征。　　 上皮细胞间质转型(epithelial-to-mesenchymaltransition，EMT)主要是指上皮细胞在形态、结构、粘附及迁移能力等方面获得间质细胞特性的过程。其主要表现为：上皮细胞表型基因如E-钙粘蛋白(E-cadherin)表达下调；间质细胞表型基因波形蛋白(vimentin)表达上调；间质细胞功能基因如α-平滑肌肌动蛋白(α-smoothmuscleactin，α-SMA)、Ⅰ型胶原(collagenⅠ)等表达明显增强。有研究显示，肝纤维化过程中伴有EMT进程，逆转EMT过程成为治疗肝纤维化的途径之一。　　 本课题组前期研究发现，经改造的苦参碱硫代衍生物M19，其药理活性显著增强，对肝纤维化的治疗效果优于苦参碱。我们前期利用连续亲和色谱法、竞争亲和色谱法结合质谱鉴定等技术，确证了苦参碱及M19的特异结合蛋白之一为核糖体蛋白S5(ribosomalproteinS5，RPS5)。另外发现，RPS5在纤维化模型大鼠肝组织中表达降低，经M19治疗后表达回升。因此我们推测，RPS5与肝纤维化过程存在密切联系。　　 RPS5是核糖体小亚基的组成蛋白之一，参与核糖体翻译、组装蛋白质的功能。晚近研究结果显示，RPS5还存在其他核糖体外功能，例如真核生物的RPS5与细胞分化、凋亡都有密切关系。近年来有报道发现RPS5在细胞中磷酸化后会发生核转移，RPS5与蛋白激酶(caseinkinase2，CK2)在细胞中发生特异性结合。这些结果提示我们RPS5在细胞内发挥重要的生理调节作用。但是，RPS5在肝纤维化中的作用目前还没有相关报道。　　 本研究主要对RPS5与肝纤维化的关系进行探索，首先构建携带人源RPS5基因的高表达腺病毒载体(AdRPS5)以及携带靶向大鼠RPS5基因的shRNA序列的小干扰腺病毒(AdshRPS5)，将其分别导入大鼠肝星状细胞系HSC-T6中，研究结果表明，RPS5的下调促进了HSC-T6的活化及EMT进程，在体外确证了RPS5与肝星状细胞的活化存在密切的联系。之后再经尾静脉注射将病毒分别导入肝纤维化大鼠体内，结果证实RPS5表达减少可以促进肝纤维化进程，RPS5上调可抑制肝纤维化过程，并且这一调节与HSCs活化和EMT进程相关；最后为阐明RPS5的作用机制，我们寻找到RPS5的作用通路和相互作用蛋白，为进一步研究RPS5的功能奠定了基础。　　 [实验方法]：　　 一、RPS5表达水平对HSC-T6生物学特性的研究　　 (一)RPS5基因沉默对HSC-T6细胞活化及EMT的影响　　 分别将干扰腺病毒AdshRPS5或对照病毒AdshNC以MOI130感染HSC-T6细胞，MTT法连续测定感染后8h、24h、48h和72h的增殖情况；realtimeRT-PCR及western-blot检测病毒感染48h后RPS5表达水平，同时检测肝星状细胞活化指标α-SMA、collagenⅠ和EMT指标E-cadherin、vimentin、snail的mRNA和蛋白的表达水平。　　 (二)RPS5基因导入对HSC-T6细胞活化及EMT的影响　　 分别将RPS5高表达腺病毒AdRPS5或对照病毒AdNC以MOI300感染HSC-T6细胞48h，western-blot检测RPS5的蛋白水平；realtimeRT-PCR检测RPS5、肝星状细胞活化指标α-SMA、collagenⅢ和EMT指标E-cadherin、snail的mRNA水平。　　 (三)RPS5基因沉默后再次导入对HSC-T6细胞活化的影响　　 分别将RPS5干扰腺病毒AdshRPS5或对照病毒AdshNC以MOI130感染HSC-T6，8h后再次导入RPS5高表达腺病毒AdRPS5，westernblot检测RPS5的蛋白水平；realtimeRT-PCR检测RPS5和肝星状细胞活化指标α-SMA、collagenⅠ的mRNA水平。　　 二、RPS5表达水平对大鼠实验性肝纤维化的作用研究　　 (一)AdshRPS5对DMN大鼠肝纤维化的促进作用　　 将雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠分为4组，第1组为无处理正常对照组，2～4组予1％DMN按照10μg/kg体重进行腹腔注射，每周连续注射3次，共注射4w，制备大鼠DMN肝纤维化模型。其中第2组设为模型组，第3组为AdshNC导入组，第4组为AdshRPS5导入组。分别于第1次注射DMN前2d及第6次注射DMN后，AdshRPS5组和AdshNC组经尾静脉注射4×109空斑形成单位/只(pfu/只)AdshRPS5或AdshNC，第二次注射病毒1w后处死大鼠，肝组织石蜡切片进行HE染色；碱水解法检测肝组织中羟脯氨酸含量；Masson’strichrome染色和Siriusred染色测定ECM含量用图象分析软件对Masson’strichrome染色结果进行半定量分析；realtimeRT-PCR、免疫组织化学法检测肝组织内RPS5及肝纤维化指标和EMT指标的mRNA和蛋白水平。　　 (二)AdshRPS5对BDL大鼠肝纤维化的促进作用　　 将雄性SD大鼠随机分为4组，分别设假手术组、模型组、AdshNC组和AdshRPS5组。制备BDL肝纤维化模型。AdshNC组和AdshRPS5组于术前2d分别经尾静脉导入4×109pfu/只AdshNC或AdshRPS5。术后2w处死大鼠，组织处理同DMN模型。　　 (三)AdRPS5对DMN损伤大鼠肝纤维化的治疗作用　　 将雄性SD大鼠随机分为4组，第1组为正常对照组，第2～4组予1％DMN，按10μg/kg体重腹腔注射，每周连续注射3次，共3w。其中第2组设为模型组，第3组为AdNC导入组，第4组为AdRPS5导入组。于第6次注射DMN后，AdRPS5组和AdNC组经尾静脉导入4×109pfu/只AdRPS5或AdNC，注射病毒2w后处死大鼠，观察指标同DMN敲减模型。　　 (四)免疫组织化学法检测RPS5在肝纤维化患者肝组织内的表达变化　　 取人正常肝组织切片及纤维化肝脏组织切片进行免疫组织化学染色，检测RPS5蛋白表达变化。　　 三、RPS5作用机制的初步探索　　 将AdshRPS5感染HSC-T6细胞48h，westernblot检测丝/苏氨酸蛋白激酶(Akt)通路相关蛋白水平；免疫组织化学法检测肝组织内p-Akt表达水平变化；免疫共沉淀法检测RPS5与Akt及p-Akt相互作用关系；免疫共沉淀结合脱磷酸化反应探究RPS5对p-Akt脱磷酸的影响。　　 四、统计学处理　　 数据采用SPSS11.0统计软件包进行分析，结果以X±S表示。多组间采用One-WayANOVA分析，方差非齐性则采用非参数检验；P<0.05为具有显著性差异，P<0.01为具有非常显著性差异。　　 [实验结果]：　　 一、RPS5表达水平对HSC-T6生物学特性的影响　　 (一)MTT结果显示，病毒感染后，与AdNC组相比，AdshRPS5显著促进细胞增殖，至72hAdshRPS5组的吸光度值较AdshNC组增加了25％(P<0.05)。realtimeRT-PCR结果显示，AdshRPS5可明显下调HSC-T6中RPS5的mRNA水平，同时促进肝星状细胞活化相关基因collagenⅠ、α-SMA和间质细胞表型基因vimentin、snail的表达(P<0.01)，抑制上皮细胞表型基因E-cadherin的表达(P<0.05)。western-blot结果显示，AdshRPS5可明显下调HSC-T6中RPS5蛋白的表达，同时促进肝星状细胞活化指标collagenⅠ、α-SMA和间质细胞表型指标vimentin的蛋白表达水平，抑制上皮细胞表型指标E-cadherin的蛋白表达水平。　　 (二)westernblot结果显示，AdRPS5可明显上调HSC-T6中RPS5的蛋白水平，realtimeRT-PCR结果显示，随着RPS5mRNA水平的升高，肝星状细胞活化指标collagenⅢ、α-SMA和间质细胞指标snail的mRNA的水平下调，E-cadherin的mRNA的水平上调(P<0.01)　　 (四)将RPS5沉默后再次转入高表达病毒，能明显逆转RPS5沉默引起的collagenⅠ和α-SMA的基因水平的上调。　　 二、RPS5表达水平对大鼠实验性肝纤维化的作用研究　　 (一)AdshRPS5对DMN肝纤维化模型的促进作用　　 AdshRPS5与AdshNC组相比，Masson’strichrome染色面积显著增加，增加幅度达170％(P<0.01)。AdshRPS5基因导入组肝组织羟脯氨酸含量为(619.6±166.8μg/g)较AdNC组(453.4±134.0μg/g)明显增加(P<0.05)。realtimeRT-PCR结果和免疫组化结果均表明导入AdshRPS5组的大鼠肝组织内随着RPS5水平的进一步降低，α-SAM、collagenⅠ和vimentin表达明显增多，E-cadherin表达减少。　　 (二)AdshRPS5对BDL肝纤维化模型的促进作用　　 Masson’strichrome染色面积半定量结果显示，AdshRPS5导入组染色面积为AdshNC对照组的157％(P<0.05)。AdshRPS5组肝组织羟脯氨酸含量(271.6±106.8μg/g)高于AdshNC组含量(228.3±74.0μg/g)(P<0.05)。realtimeRT-PCR和免疫组化结果表明导入AdshRPS5组的大鼠肝组织内随着RPS5水平的进一步降低，α-SAM和vimentin表达明显增多。　　 (三)AdRPS5对DMN模型肝纤维化的治疗作用　　 AdRPS5组Masson’strichrome染色面积为AdNC导入组的89％，差异均有统计学意义(P<0.05)；AdRPS5组羟脯氨酸含量(400.8±57.2μg/g)低于AdNC组(471.3±74.5μg/g)；realtimeRT-PCR和免疫组化结果表明，导入AdRPS5组中RPS5的mRNA和蛋白水平上调，同时显著抑制了α-SAM和vimentin的mRNA和蛋白表达，促进E-cadherin的mRNA和蛋白表达，表现出逆转EMT和肝纤维化的作用。　　 (四)免疫组织化学法检测RPS5在肝纤维化患者肝脏内的表达变化，结果发现，与正常肝脏相比，RPS5在纤维化患者的肝脏内表达明显降低。　　 三、RPS5作用机制的初步研究　　 将AdshRPS5导入HSC-T6细胞中，RPS5的沉默提高了丝/苏氨酸蛋白激酶(Akt)的磷酸化水平；免疫组织化学结果显示p-Akt在BDL或DMN致大鼠肝纤维化模型肝组织中的水平明显上调；免疫共沉淀结果显示RPS5与p-Akt存在相互作用关系；RPS5参与p-Akt的脱磷酸过程。　　 [结论]：　　 1.RPS5基因沉默后引起HSC-T6细胞的进一步活化及EMT进程。　　 2.AdshRPS5体内基因沉默可加剧肝纤维化及EMT进程；AdRPS5体内基因导入可明显抑制肝纤维化及EMT进程。　　 3.RPS5基因沉默提高了Akt的磷酸化水平，且RPS5与p-Akt存在相互作用关系，RPS5参与p-Akt的脱磷酸化过程。　　 4.p-Akt在肝纤维化过程中表达增加。　　 综上所述，这些结果表明，RPS5水平表达下调可促进肝星状细胞活化和EMT进程，从而加剧肝纤维化；RPS5通过与p-Akt相互作用，抑制Akt磷酸化是其抑制肝纤维化的重要作用机制，提示RPS5是肝纤维化治疗的新靶点。