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玫烟色拟青霉(Paecilomyces fumosoroseus)是一种丝孢类昆虫病原真菌,寄主范围广,在害虫生物防治方面的开发和应用潜力很大。由于所有生防真菌制剂的的有效成份都具有细胞结构的侵染体,菌种的生态适应性和环境抗逆性(如耐旱、耐暑、耐紫外辐射、抗杀菌剂、抗除草剂等性状)在很大程度上决定了菌剂的田间适用性和应用效果。因此,杀虫效果和工艺性状良好的生产菌株,再通过遗传操作和定向选育而获得一些抗逆性状,是提高生防真菌制剂技术水平的基本途径。本研究旨在构建基于限制性内切酶介导整合(Restriction enzyme-mediated integration,REMI)和原生质体的玫烟色拟青霉遗传操作技术平台,并尝试将抗草丁膦除草剂的基因导入一株具有生防潜力的玫烟色拟青霉基因组中,为生防真菌的遗传改良和分子育种奠定基础。主要结果如下: 玫烟色拟青霉原生质体的制备 供试菌株为源自甘薯粉虱(Bemisia tabaci)的玫烟色拟青霉Pfr116菌株,对粉虱、蚜虫及叶螨等刺吸式口器害虫具高毒力。将其分生孢子均匀悬浮于萨氏培养液中,25℃振荡(120r/min)培养24h后,按10%的比例转接和扩大培养24h。所获菌丝经0.3% 2-毓基乙醇预处理10min,以0.6mol/L KC1作为原生质体制备的渗透压稳定剂,试验了5种不同酶系(2%蜗牛酶、2%裂解酶、0.5%蜗牛酶+1.5%裂解酶、1.5%蜗牛酶+0.5%裂解酶及1%蜗牛酶+0.6%溶菌酶+0.4%纤维素酶)对菌丝的原生质体转化效果。结果表明,以0.5%蜗牛酶+1.5%裂解酶的混合酶,在28℃下振荡(90r/min)酶解菌丝2h,菌丝的原生质体转化率(1.1×10~6个/mg菌丝)最高。以0.8mol/L蔗糖作为原生质体再生阶段的渗透压稳定剂和查氏培养基作为再生基质,对所制备的原生质体进行再生培养,获得了25.7%的再生率。 限制性内切酶介导的原生质体转化及分子鉴定 在对比筛选试验中,Pfr116菌株的原生质体对潮霉素(HygB)不敏感,在0.4mg/mL的浓度下也不能抑制原生质体生长,而0.3mg/mL草丁膦(PPT)对原生质体的抑制效果良好,因此构建了带PPT抗性基因Bar的质粒pAn52-1N-Bar进行原生质体的转化。质粒pAn52-1N-Bar用Hind Ⅲ单酶切线性化,以Cycle-Pure Kit回收,质粒DNA浓度为107.5μg/mL。运用Hind Ⅲ介导的REMI技术,在含0、10、30和50U的4个内切酶单位的50μL反应体系中,用线形质粒对原生质体进行转化,再在0.3mg/mL草丁膦的查氏再生平板上培养5d。结果显示,10U和30U的内切酶单位处理获得了较高的转化率(12个转化子/μg质粒DNA),