论文部分内容阅读
目的：观察骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植对早产儿脑白质损伤模型大鼠脑内肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)水平及活化小胶质细胞数量的影响,同时评估大鼠远期神经行为功能。探讨BMSCs修复早产儿脑白质损伤的可能机制。方法：1.取EGFP (enhanced green fluorescent protein, EGFP)转基因大鼠的胫、股骨骨髓,采用全骨髓贴壁法分离培养、纯化BMSCs;荧光倒置显微镜下观察干细胞形态；流式细胞仪分析细胞表型分子；CCK-8法绘制细胞生长曲线并与野生型BMSCs增殖情况相比较；分别向成脂、成骨、成软骨诱导分化鉴定EGFP-BMSCs;2.将3日龄清洁级SD大鼠随机分为三组：WMD模型组、BMSCs移植组和假手术组。WMD模型组和BMSCs移植组大鼠经异氟烷麻醉后予双线结扎左侧颈总动脉并吸入氧浓度为6%的氧氮混合气体2 h,制作早产儿脑白质损伤模型。假手术组大鼠麻醉后仅游离左侧颈总动脉,不做缺血缺氧处理。BMSCs移植组造模后经左侧脑室定位注射EGFP-BMSCs悬液2 μl(含细胞2×105个),WMD模型组造模后经左侧脑室定位注射2μlPBS,假手术组不予颅内注射；3.干预7d后,采用HE染色法观察脑组织病理改变、免疫组织化学法检测各组大鼠脑中ED-1阳性细胞数；干预7d、27d后,采用免疫荧光法检测EGFP-BMSCs在大鼠脑部的定植情况；在分别干预6h、12 h、24 h、48 h、7 d后,采用ELISA和RT-PCR检测各组大鼠脑组织中TNF-α、IL-1β含量及mRNA的表达水平；4.随访观察大鼠至术后27d后,称量并记录术前、术后24h、48h、7d、27d的实验动的体重,并在术后27d进行动物神经行为学检测评估各组大鼠的神经功能情况；5.统计学分析：采用SPSS 19.0统计软件进行实验数据统计分析。正态分布计量资料以x±s表示,组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD检验。两样本均数比较用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。结果：1.获得稳定表达EGFP的BMSCs,以长梭形为主,融合后呈漩涡状排列；生长曲线示EGFP-BMSCs增殖能力旺盛,与野生型BMSCs比差异无统计学意义(t=-0.023,P=0.982)；细胞CD29、CD90、CD34、CD49d、CD45表达率分别为99.4%、96.4%、0.171%、0.049%、0.038%；成脂、成骨、成软骨诱导后,分别予以油红O、茜素红、甲苯胺蓝染色,结果均呈阳性；2.干预7d后,HE染色结果显示WMD模型组的大鼠脑白质区见部分细胞变性、坏死；BMSCs移植组的大鼠脑白质区未见明显细胞水肿、变性和坏死；假手术组大鼠脑部未见明显异常。免疫组织化学检测结果显示WMD模型组的大鼠脑内ED-1阳性细胞数明显多于BMSCs移植组,假手术组明显少于BMSCs移植组和WMD模型组(LSD检验,P值均<0.05)。免疫荧光观察显示EGFP-BMSCs存活并定植于脑组织,但在干预27d后,脑内定植的细胞基本消失。干预6h、12 h、24 h、48 h和7d后,WMD模型组的大鼠脑内TNF-α、IL-1β蛋白水平均在24 h达到峰值,随后呈下降趋势,至7d时仍未降至正常水平；WMD模型组的大鼠在各时间点TNF-α、IL-1β蛋白表达水平显著高于BMSCs移植组,假手术组TNF-α和IL-1p蛋白表达水平最低,差异均有统计学意义(LSD检验,P值均<0.05)。干预24 h后,WMD模型组TNF-α和IL-1β mRNA表达水平高于BMSCs移植组,假手术组表达水平明显低于BMSCs移植组和WMD模型组,差异均有统计学意义(LSD检验,P值均<0.05)。3. BMSCs移植组大鼠远期神经功能发育及动物体重较WMD模型组大鼠有所改善(LSD检验,P值均<0.05)。结论：本实验成功获得高纯度、稳定表达EGFP的BMSCs,干细胞特性不受EGFP影响,细胞定植后,示踪效果良好；3日龄幼大鼠予缺血缺氧处理造成的脑损伤符合早产儿脑白质损伤病理学改变。BMSCs移植可以有效改善大鼠神经功能恢复,其修复缺氧缺血导致的脑白质损伤可能与其抑制病变早期小胶质细胞激活,通过旁分泌机制下调炎症因子TNF-α、IL-1β的表达,进而减轻早期炎症反应有关。