论文部分内容阅读
我国自2013年12月首次在江苏省的活禽交易市场中发现了H5N6亚型禽流感病毒以来,在黑龙江、广东、甘肃、湖北等地接连又爆发了H5N6亚型高致病性禽流感疫情,造成大量家禽的死亡。与此同时,2014年5月四川发生了全世界首例H5N6亚型流感病毒引起的重症死亡病例,随后在广东、云南、江西、湖南等地不断有人感染H5N6亚型流感病毒的报道。截止到2016年一共16人感染,其中10人死亡。由此可见,H5N6不仅能够引起家禽死亡严重制约养殖业的发展,还因其较高的病死率成为人类生命健康的又一重大威胁。为了了解近几年H5N6亚型AIV的分子特点和遗传演化关系,禽流感流行病学监测中,基于广东、云南和福建特殊的地理位置和环境气候条件,本研究选取近两年来从这三个省份的禽类中分离到的10株H5N6亚型禽流感病毒,进行了全基因序列分子特性分析和遗传演化分析。HA基因遗传演化分析发现,除云南分离株MZ151的HA基因分布于2.3.2分支外,其他9株病毒均分布在2.3.4.4分支。10株病毒HA基因碱性裂解位点附近的氨基酸主要有两种类型,分别为KERRRKR↓GLF和RERRRK R↓GLF,均由多个连续的碱性氨基酸K/R构成,符合高致病性禽流感病毒典型的分子特征。HA蛋白的Q226L和G228S均未发生突变,表明这些病毒依然以结合唾液酸α2,3-半乳糖苷受体为主。但HA蛋白I155T、N158D、T160A、S239P发生了突变,表明这些病毒可能同时获得了结合唾液酸α2,6-半乳糖苷受体的能力。NA基因序列分析发现,10株病毒的NA基因全部来源于H6N6亚型流感病毒,并且颈部都存在11个氨基酸的缺失。内部基因序列分析发现,10株病毒的PB2基因均来源于H6N6亚型禽流感病毒,其他大部分内部基因则来源于H5亚型禽流感病毒,其中PB2蛋白E627K和D701N均未发生突变,而PB2蛋白A588V,M1蛋白N30D、T215A以及NS1蛋白P42S、D92E发生了突变,表明这些病毒可能对哺乳动物也具有一定的致病力。为了应对目前我国广泛流行的2.3.4.4分支的高致病性H5N6亚型禽流感病毒,研发针对流行毒株的候选疫苗是十分必要的。根据HA基因进化树,选取位于2.3.4.4分支的A/duck/Fujian/16469/2016(H5N6)作为疫苗候选供体毒株。利用课题组建立的D7疫苗株反向遗传疫苗开发平台,通过分子修饰删除了供体毒株HA基因裂解位点附近的多个连续碱性氨基酸,拯救出候选疫苗株r16469,使其具备了低致病性禽流感病毒的分子特征。r16469株具有良好的免疫原性,制备的灭活疫苗单次免疫SPF鸡就可以诱导产生高水平的HI抗体。免疫SPF鸡21天后,以106EID50/200μL的剂量进行点眼滴鼻攻毒,结果表明r16469株对H5N6亚型禽流感病毒YN0928株和16469株的攻击提供完全保护,攻毒后不发病,不排毒。