目的:以昆明小鼠胚胎为实验材料。采用苏木精-伊红染色、Masson染色、PAS染色、免疫组化染色等方法,对小鼠胚胎不同发育阶段的性腺、皮肤和肝脏中干细胞的来源、迁移、增殖及形态变化进行研究。皮肤和肝脏发育的机制为胚胎发育分子水平调控机制的深化研究提供了组织学依据。方法:1.Bouin固定液具有浸润快、固定均匀、组织收缩小、对细胞和组织微结构保存效果好等优点;2.脱水始于低浓度的30%酒精,防止胚胎组织过度收缩;3.二甲苯能控制透明速度,防止胚胎组织脆化。比甲苯更适合于胚胎组织切片的制备;4.在17天左右的时候,组织切片标本的制备是从胚胎的中线到矢状面分割的,这样更有利于保存胚胎器官的精细结构。结果:1.小鼠胚胎干细胞分化的生殖腺细胞发育形态学及免疫组化研究1)性腺发育始于10日龄小鼠胚胎性腺内侧,11日龄时出现生殖腺嵴,12日龄时形成未分化生殖腺,13日龄胚胎标本切片可区分雌雄性;14日龄雄性生殖腺出现睾丸结构,16日龄雌性生殖腺开始发育为卵巢,20日龄精曲小管分化为两层细胞,此时底层分支,卵巢皮质有许多原始卵泡。2)在胚胎发育的不同阶段,Oct-4在性腺干细胞中的表达呈现动态变化;随着精曲小管的发育,Oct-4阳性细胞的表达逐渐增强和减弱。13-16日龄小鼠胚胎睾丸中存在两种Oct-4阳性干细胞,一种是强阳性的前体细胞,另一种是弱阳性的精原细胞。17天后,Oct-4在性腺中的表达逐渐下降。2.小鼠胚胎干细胞分化的皮肤细胞发育的形态学及免疫组化研究HE染色结果发现:10日龄小鼠胚胎皮肤由一层扁平细胞组成,细胞间无明显分界线。11-12日龄皮肤由双层细胞组成。13日龄时,表皮分为三层,表皮粗糙,胶原合成,真皮出现疏松结缔组织。14日龄时,毛囊原基形成,真皮增厚,表皮与真皮紧密接触。15-16日龄小鼠胚胎的表皮、真皮和皮下组织可与皮肤区分开,皮肤组织结构逐渐成熟。17日龄小鼠胚胎皮肤具有成体皮肤组织结构特征。18天后,皮肤组织结构保持不变。免疫组化结果显示:Nesitn在小鼠胚胎不同发育阶段的皮肤中均有强表达。它首先在表皮前体细胞中表达,然后在基底细胞中表达,最后在毛囊前体细胞和一些基底干细胞中迁移和保留。此外,Nesitn在13日龄左右的皮肌细胞中也有强烈表达。3.小鼠胚胎干细胞分化肝细胞的形态学及免疫组化研究形态学观察结果表明,9日龄小鼠胚胎前肠末端形成了具有毛囊结构的肝原基。10日龄时,肝细胞排列不规则,相互连接成网络,血窦内有造血细胞。12-13天是肝脏发育的高峰期,肝细胞数量增多,肝细胞体积增大,出现中央静脉和巨核细胞。14日龄时,胚胎肝小叶出现,但未成熟。15-16日龄时,肝小叶进一步成熟,出现原发性门脉区。17-18日龄肝脏出现第二肝门区,糖原合成达到高峰。Oct-4免疫组化研究显示:Oct-4阳性细胞开始出现在11日龄小鼠胚胎中,但呈散在分布,无规律性分布。Oct-4在12日龄时呈卵圆细胞表达。随着门区的发育,Oct-4阳性卵圆细胞逐渐向门区迁移。17天左右,基本局限于小叶间胆管、血管周围和中央静脉周围。结论:1.鼠整胚组织切片标本的制作与观察改进的组织切片标本制备方法有利于通过不同的染色方法,使小鼠胚胎组织切片中细胞和组织形态及某些化学成分的变化得到完美的显示。更重要的是,它能保证胚胎中每个器官的位置相对固定。2.小鼠胚胎干细胞分化的生殖腺细胞发育形态学及免疫组化研究1)胚胎发生早期就有生殖细胞,生殖细胞的迁移、增殖和分化与精曲小管的发育密切相关。2)性腺干细胞Oct-4表达的动态变化。Oct-4可以作为一种特异的表面标记蛋白。在原胚细胞中呈强阳性表达,精原细胞中呈弱阳性表达。随着精曲小管的成熟和分化,Oct-4的表达逐渐减少和消失。3.小鼠胚胎干细胞分化的皮肤细胞发育的形态学及免疫组化研究1)小鼠胚胎发育的13-14天是皮肤发育最活跃的时期,表皮、真皮和毛囊前体细胞的生长达到了前所未有的活跃状态。2)Nesitn的表达与表皮、真皮的发育及皮肤干细胞的迁移密切相关。4.小鼠胚胎干细胞分化肝细胞的形态学及免疫组化研究小鼠胚胎发育过程中,肝干细胞主要集中在小叶间胆管、血管和中央静脉周围,可能是肝干细胞的储备区。Oct-4在胚胎肝发育过程中可能对维持肝干细胞的未分化特性和多向分化潜能发挥重要作用。