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复方当归注射液(Compoundangelicainjection,CAI)是由当归、川芎、红花配伍组成的复方制剂,具有活血通络、祛瘀止痛功效。课题组前期研究发现,CAI对大鼠永久性大脑中动脉闭塞(Middle cerebral artery occlusion,MCAO)所致的缺血性脑卒中模型具有潜在的神经保护作用,但更深入的作用机制仍待阐述。随着对缺血性脑卒中研究的不断深入,越来越多的证据表明炎性反应是促进缺血性脑卒中发生发展的重要因素,而酪氨酸激酶2/信号转导子和转录激活子3(Janus-activated kinase2/Signal transducer and activator of transcripti3,JAK2/STAT3)信号通路是一条重要的炎性反应相关通路,且研究证实其参与了缺血性脑卒中发生发展的过程。因此本研究基于JAK2/STAT3信号通路,探讨CAI对缺血性脑卒中炎性反应的可能作用,从而揭示CAI对缺血性脑卒中保护作用的机制。目的:基于JAK2/STAT3信号通路探讨CAI对缺血性脑卒中炎性反应的作用。建立大鼠永久性MCAO模型,从神经功能、脑梗死体积、大脑皮层病理形态学观察CAI对缺血性脑卒中大鼠的影响,并从白介素-6(Interleukin-6,IL-6)、JAK2/STAT3信号通路探讨CAI对缺血性脑卒中大鼠炎性反应的作用;利用CAI作用的脑微血管内皮细胞(Brain microvascular endothelial cells,BMECs)的条件培养液,干预拟缺血损伤小胶质细胞(Microglia,MG),从细胞形态和细胞活性观察CAI对拟缺血损伤MG的影响,并从细胞迁移、JAK2/STAT3信号通路探讨CAI对拟缺血损伤MG炎性反应的作用。方法:1.研究CAI对缺血性脑卒中大鼠神经功能、脑梗死体积、大脑皮层病理形态学影响:将Sprague Dawley(SD)大鼠随机分为空白对照组、假手术组、造模组。造模组通过线栓法建立大鼠永久性MCAO模型。造模后,将动物随机分为模型组(3 mL·kg-1生理盐水)、CAI组(5 mL·kg-1 CAI)、依达拉奉组(3 mL·kg-1依达拉奉注射液),给药干预7 d后,通过神经功能评分观察各组大鼠神经功能、氯化三苯基四氮唑(Triphenyl tetrazolium chloride,TTC)染色法观察各组大鼠脑梗死体积、苏木精-伊红(Hematologist eosin staining,HE)染色法观察各组大鼠大脑皮层病理形态学。2.研究CAI对缺血性脑卒中大鼠IL-6和JAK2/STAT3信号通路的影响:通过酶联免疫吸附测定(Enzyme linked immune sorbentassay,ELISA)法检测各组大鼠血浆中IL-6的表达水平、免疫印迹法(Western blot)检测各组大鼠脑组织中JAK2/STAT3信号通路相关蛋白磷酸化酪氨酸激酶 2(Phospho-Janus-activatedkinase2,p-JAK2)、JAK2、磷酸化信号转导子和转录激活子 3(Phospho-Signal transducer and activator of transcripti3,p-STAT3)、STAT3的表达水平。3.研究CAI作用的BMECs条件培养液对拟缺血损伤MG的细胞形态和细胞活性的影响:原代培养BMECs,通过免疫荧光鉴定BMECs的纯度,实验用培养至第三代的BMECs,将其分为正常组、模型组、低剂量CAI组(1.25μL·mL-1)、中剂量CAI组(2.5μL-mL-1)、高剂量CAI组(5μL·mL-1)。模型组和各剂量CAI组通过氧糖剥夺法(Oxygen and glucose deprivation,OGD)建立BMECs拟缺血损伤模型,造模后,收集各组条件培养液,即正常BMECs条件培养液(Normal-Conditioned medium,N-CM)、拟缺血损伤BMECs 条件培养液(Ischemic-Conditionedmedium,I-CM)及低、中、高剂量 CAI 作用后的各拟缺血损伤BMECs条件培养液(Ischemic CAI-Conditioned medium,IC-CM;其中,1.25 μL·mL-1CAI 作用 BMECs 的 IC-CM 作为 IC-CML,2.5 μL·mL-1CAI 作用的 IC-CM作为IC-CMM,5 μL·mL-1CAI作用的IC-CM作为IC-CMH)。原代培养MG,通过免疫荧光鉴定MG的纯度,实验用培养至第三代的MG,分为N-CM组、I-CM组、IC-CML组、IC-CMM组、IC-CMH组,分别用对应的BMECs条件培养液干预MG,除N-CM组,其余各组均通过OGD法建立MG拟缺血损伤模型。通过倒置显微镜观察各组MG的细胞形态,通过细胞计数试剂盒(Cell Counting Kit-8,CCK-8)检测各组MG的细胞活性。4.研究CAI作用的BMECs条件培养液对拟缺血损伤MG细胞迁移和JAK2/STAT3信号通路的影响:通过细胞迁移实验技术(Transwell)来观察各拟缺血损伤组MG的迁移,通过Western blot检测各组MG中JAK2/STAT3信号通路相关蛋白p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3的表达水平。结果:1.CAI对缺血性脑卒中大鼠具有神经保护作用,可以改善神经功能及大脑皮层病理形态学损伤,同时具有减小脑梗死体积的趋势。神经功能评分结果显示,与模型组比,CAI组神经评分明显降低(P<0.01)。TTC染色结果显示,与模型组相比,CAI组脑梗死体积具有减小趋势。HE染色结果显示,模型组的大脑皮层细胞排列稀疏且紊乱,细胞核固缩,数量明显减少,而与模型组相比,CAI组大脑皮层细胞排列较为有序,细胞核固缩现象减少,坏死的细胞数量明显减少。2.CAI可以通过抑制IL-6的表达和JAK2/STAT3信号通路的异常激活减轻缺血性脑卒中大鼠的炎性反应。ELISA结果显示,与假手术组比,模型组血浆中IL-6含量明显增多(P<0.01);与模型组相比,CAI组血浆中IL-6含量明显减少(P<0.01)。Western blot结果显示,与假手术组比较,模型组脑组织中p-JAK2/JAK2和p-STAT3/STAT3/水平显著升高(P<0.01);与模型组比较,CAI组脑组织中p-JAK2/JAK2和p-STAT3/STAT3水平均显著降低(P<0.01)。3.CAI作用的BMECs条件培养液可以改善拟缺血损伤MG的细胞形态和细胞活性。免疫荧光染色结果显示,原代培养的第三代BMECs和MG纯度均可达95%以上,可以用于后续实验。细胞形态观察结果显示,各剂量IC-CM组均可减轻OGD对MG的损伤,细胞体积增大、细胞间距减小、存活MG数量增多。CCK-8结果显示,各剂量IC-CM组均可提高OGD造模后MG存活率,其中IC-CMM、IC-CMH组明显提高(P<0.05,P<0.01)。4.CAI作用的BMECs条件培养液可以通过抑制MG的迁移以及JAK2/STAT3信号通路的异常激活减轻拟缺血损伤MG的炎性反应。细胞迁移实验结果显示,与I-CM组相比,各剂量IC-CM组均使得穿越滤膜染成紫色即迁移的MG数量明显减少(P<0.05)。Western blot结果显示,与N-CM组比较,I-CM组p-JAK2/JAK2和p-STAT3/STAT3水平显著升高(P<0.01);与I-CM组比较,各剂量IC-CM组p-JAK2/JAK2和p-STAT3/STAT3水平呈降低趋势,其中IC-CMM、IC-CMH组明显降低(P<0.01)。结论:1.CAI可以改善缺血性脑卒中大鼠的神经功能及大脑皮层病理形态学损伤,具有神经保护作用,其保护作用机制可能与通过抑制IL-6的表达以及JAK2/STAT3信号通路的异常激活减轻炎性反应有关。2.CAI作用的BMECs条件培养液可以改善拟缺血损伤MG的细胞形态、提高细胞活性,其作用机制可能与通过抑制MG迁移以及JAK2/STAT3信号通路的异常激活减轻炎性反应有关。3.JAK2/STAT3信号通路可能是CAI减轻缺血性脑卒中炎性反应,发挥神经保护作用的药效靶点之一。