论文部分内容阅读
以含MnSO4或Na2CrO4的无钼无氨的修改Burks培养基，培养不能合成含钼固氮酶体系的棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii Lipmann)突变种UW3，发现在一定浓度范围内，MnSO4或Na2CrO4的加入有助于促进其生长.菌体生长和C2H2还原活性曲线测定结果表明，这种促进作用很可能是通过Mn或Cr取代Mo，参与组装固氮酶中心原子簇，从而影响固氮活性而实现的.
利用阴离子交换(DEAE-52和Q-Sepharose FF)和凝胶过滤(Sephacryl S-200)柱层析从两种菌体中纯化得到固氮酶组分I蛋白(分别命名为MnFe蛋白和CrFe蛋白)，并对其进行了特性研究.厌氧天然聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和SDS-PAGE结果显示，两种蛋白均为两种亚基组成的四聚体.亚基可以与OP MoFe蛋白抗体发生免疫反应,分子量分别略小于野生种OP MoFe蛋白的α和β亚基.CrFe蛋白的C2H2还原活性，Ar下放氢活性和固氮活性分别相当于OP MoFe蛋白的36％，38％和43％，而MnFe蛋白活性相当于OP MoFe蛋白的50％左右，并且两种蛋白与OP MoFe蛋白具有相似的固氮电子利用率.对两种蛋白金属含量的测定证实其中分别含有Mn和Cr,但仍存在少量Mo污染.与OPMoFe蛋白相比，这两种蛋白圆二色谱的摩尔椭圆率([θ])除在450nm较接近外，在可见光区的其它波长处均显著降低.与DT还原OP MoFe蛋白相似，CrFe蛋白和MnFe蛋白具有g≈4.3、3.7和2.0的特征EPR信号，但各处信号强度比例不同.在对污染Mo可能引起的信号进行校正后，CrFe蛋白的三个信号强度分别相当于DT还原OP MoFe蛋白的20％，0％和10％，而MnFe蛋白则分别相当于112％，49％和65％.上述结果表明，CrFe蛋白和MnFe蛋白与OP MoFe蛋白金属原子簇的主要差异很可能在于FeMco(M=Cr,Mn或Mo)的M种类，而P-cluster结构和组成均未见大的差异.
利用气相扩散悬滴法对MnFe蛋白和CrFe蛋白结晶条件进行了筛选和初步优化，确定了以Tris/Hepes，NaCl，MgCl2和PEG8000为主要变量的沉淀剂体系，寻找各组分对于晶体生长的最适浓度.以此为基础探讨了应用气相扩散坐滴法和液-液扩散法对两种蛋白结晶条件的优化.在一定条件下，两种蛋白分别通过液-液扩散法获得了优质大单晶.对从CrFe蛋白和MnFe蛋白制备物中培养出的蛋白质晶体的SDS-PAGE鉴定显示，晶体由与OP MoFe蛋白相似的两种亚基组成.通过“神舟三号”飞船搭载实验探讨了空间微重力对于厌氧蛋白质结晶的影响，结果表明，微重力有助于避免孪晶形成，并具有长期培养后获得适于进行X-射线衍射分析的优质大单晶的潜在前景.结合空间科学使固氮酶结构与功能研究得以发展，这项工作是有意义并且可行的.