目的(1)对新生大鼠心肌细胞(neonatal rat cardiomyocytes,NRCMs)的分离培养方法进行优化,寻找一种较为高效的新生大鼠心肌细胞分离培养方法;(2)研究CTRP3在心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia/reperfusion injury,MIRI)中的作用。方法(1)新生大鼠心肌细胞的分离培养。无菌操作快速取得大鼠乳鼠心脏后以机械处理将心脏剪为心肌组织块;采用两种消化方法分别对心肌组织进行消化:(1)双酶消化法:0.08%胰酶和0.125%胶原酶混合(1:1)消化心肌组织,(2)0.08%胰酶+机械消化法:先用0.08%胰酶消化心肌组织后再以机械消化法消化剩余的心肌组织;用100μm的细胞筛过滤得到的细胞混悬液,然后进行差速贴壁培养;通过台盼蓝染色法检测差速贴壁分离后的细胞数量及存活率,在光学倒置相差显微镜下观察细胞的形态及特征,用共聚焦免疫荧光染色法鉴定新生大鼠心肌细胞的纯度。(2)缺氧/复氧损伤模型构建:应用氮气避氧法(三气培养箱)建立NRCMs缺氧/复氧损伤模型。(3)应用MTT法检测NRCMs对药物(CTRP3)的反应性。(4)应用比色法检测对照组、H/R组、CTRP3预处理组的乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化物(SOD)活性,丙二醛(MDA)含量,用Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡。结果(1)两种消化方法所得原代心肌细胞在细胞形态、开始出现自发性搏动的时间等方面无显著性差异。未贴壁的心肌细胞呈圆形,折光性强。贴壁后心肌细胞伸出伪足,呈菱形、梭形、或不规则状。在铺板24h时部分心肌细胞贴壁并可观察到自发搏动。在48h细胞贴壁达98%并可观察到细胞簇之间的同幅搏动。(2)0.08%胰酶+机械消化法培养的NRCMs在细胞数量、存活率、纯度、活力等方面优于双酶消化法(p<0.05)。(3)与双酶消化法相比,0.08%胰酶+机械消化法培养的NRCMs药物反应性较好。(4)与H/R损伤组相比,CTRP3预处理细胞存活率提高,SOD活性增加,LDH活性降低,MDA含量减少,凋亡细胞减少。结论(1)0.08%胰酶+机械消化法培养的新生大鼠心肌细胞数量多、存活率高、纯度高、活力好、药物反应性好,是一种优化的新生大鼠心肌细胞分离培养方法;(2)CTRP3可能通过减轻氧化应激损伤、抑制细胞凋亡对心肌缺血再灌注损伤发挥保护作用。