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糖尿病肾病(DN)是糖尿病最常见的微血管并发症之一,在我国,发病率仅次于高血压肾病,是引起终末期肾病(ESRD)的第二原因。糖尿病肾病的发病机制尚不十分清楚,已知与遗传、糖基化、活性氧自由基的产生、缺氧及细胞因子等众多因素有关,其中肾组织缺氧被认为是导致糖尿病肾病的最主要原因之一。有报道显示,在糖尿病发病初期,由于长时间的供氧减少及氧耗增加,肾组织处于持续性的低氧状态,是引起终末期肾病的主要原因。缺氧诱导因子(HIF-1α)在低氧反应基因的诱导中具有不可或缺的作用。它是以异二聚体形式存在的转录因子,可以与DNA特异性结合。HIF-1α对氧浓度较敏感,低氧状态下,其α亚基聚集并与HIF β结合形成稳定、有功能的异源二聚体,启动目标靶基因的转录,以适应低氧状态。当HIF-α或β亚基缺乏时,因不能形成有活性的异二聚体而导致低氧相关基因的诱导表达受限。据文献报道,在糖尿病肾病的肾组织中HIF-1α表达水平明显上调,但HIF-1α在糖尿病肾病发生发展中的具体作用尚不明确。本实验以此为出发点,通过Cre/Loxp重组酶系统构建HIF-1α基因敲除小鼠模型,应用链脲佐菌素(STZ)注射法建立糖尿病肾病小鼠模型,探究HIF-1α对糖尿病肾病的具体作用及可能机制。目的:利用HIF-1α基因敲除小鼠动物模型,探究HIF-1α对糖尿病肾病肾组织损害的影响及可能机制。方法:利用HIF-1α基因LoxP标记小鼠和Mx-Cre转基因小鼠建立MX/HIF-1α基因敲除小鼠,应用STZ诱导MX/HIF-1α基因敲除小鼠(HIF-1α-/-组)及C57BL/6野生型小鼠(WT组)建立糖尿病小鼠模型,造模成功后观察小鼠血糖、体重变化,并记录糖尿病肾病小鼠的成模率及生存率;采用Western blot方法观察每组小鼠肾组织内HIF-1α蛋白的表达水平,留取肾组织标本进行PAS、Masson染色观察肾组织形态学改变,并通过透射电子显微镜观察肾小球改变,造模后每周检测各组糖尿病小鼠24小时尿微量白蛋白、尿微量白蛋白尿肌酐比值(UACR)、尿白蛋白排泄率(UAER),检测各组糖尿病小鼠肾组织微循环灌注情况,并于预定时间点检测每组小鼠肾重比体重比及血肌酐、尿素氮值。结果:1.利用Cre/loxP重组酶系统构建HIF-1α基因敲除小鼠,小鼠基因型通过PCR凝胶电泳鉴定,选取Mx-Cre阳性且HIF-1α纯合LoxP标记小鼠进行干扰素诱导剂PIPC注射,以获得HIF-1α基因敲除小鼠。2.糖尿病肾病小鼠模型的建立(1)通过STZ注射,造模后小鼠血糖均≥16.7mmol/L,显著高于正常水平,糖尿病小鼠造模成功后,体重与造模前相比随时间进行性下降(P<0.05);(2)通过肾组织PAS染色观察到造模后第10周,HIF-1α-/-组小鼠糖尿病肾病成模率达83%,而WT组糖尿病小鼠成模率为0(P<0.05);(3)与WT组糖尿病小鼠相比,HIF-1α-/-组糖尿病小鼠生存率明显下降(P<0.05);3.HIF-1α在糖尿病小鼠肾组织内的表达情况Western blot结果显示WT组糖尿病小鼠在造模后第8周,HIF-1α表达明显上调,在HIF-1α-/-组糖尿病小鼠肾组织内几乎检测不到HIF-1α (P<0.05)。4.HIF-1α-/-对糖尿病小鼠组织形态学的影响(1)肾组织PAS染色结果显示:WT组糖尿病小鼠肾小球基底膜尚且完整,未见明显增厚,间质中可见系膜基质及纤维组织轻度增多;而HIF-1α-/-组糖尿病小鼠肾小球系膜区明显增宽,系膜细胞及基质弥漫性增生,部分肾小球体积缩小(P<0.05)。(2)肾组织Masson染色结果显示:WT组糖尿病小鼠间质中未见胶原纤维沉积;而HIF-1α-/-组糖尿病小鼠肾小球、肾小管间质内可见大量胶原纤维沉积,间质增宽伴有广泛纤维化改变(P<0.05)。(3)电镜观察发现:WT组糖尿病小鼠足突融合较轻,排列较整齐,未见明显增宽,基底膜轻度增生,基质较均匀;而HIF-1α-/-组糖尿病小鼠足细胞突起减少,广泛融合,间隙增宽,基底膜局部厚薄不一,具有统计学意义(P<0.05)。5.HIF-1α-/-对糖尿病小鼠肾脏生理功能的影响(1)与WT组糖尿病小鼠相比,HIF-1α-/-组糖尿病小鼠从造模后第4周开始尿微量白蛋白、UACR、UAER明显增高(P<0.05)。(2)HIF-1α-/-组糖尿病小鼠与WT组糖尿病小鼠相比,造模8周后肾组织微循环灌注明显下降,肾重比体重比、血肌酐、尿素氮值明显增加(P<0.05)。结论:1.通过Cre/Loxp系统成功构建HIF-1α基因敲除小鼠。2.HIF-1α敲除对糖尿病小鼠的血糖及体重变化无明显影响。3.在糖尿病小鼠肾组织内,HIF-1α表达明显增加,说明肾组织内存在缺氧状况。4.HIF-1α的缺失显著加剧糖尿病小鼠的肾组织损害,其机制可能与未能改善肾组织缺氧状态有关。