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血管内皮处于血液与组织的界面,具有调节血管张力、血管生长、参与炎症-免疫反应,维持凝血-纤溶平衡等多种功能。内皮功能不全在高血压发生发展中的作用已日益引起重视并被认为是心血管疾病的独立危险因素。
BH4缺乏与血管内皮功能异常密切相关。大量研究表明,在高血压,糖尿病,高脂血症等多种内皮功能异常的动物模型,均发生BH4含量下降,NO生成减少以及超氧阴离子增加,同时内皮依赖性血管舒张功能降低。相应的,外源性补充BH4或其Salvage通路的底物墨蝶呤或基因转移BH4合成的限速酶GTPCH Ⅰ可增加eNOS活性,降低超氧阴离子水平,并恢复内皮功能。临床研究也表明,在高血压,高胆固醇血症,Ⅱ型糖尿病,冠状动脉粥样硬化,慢性心哀和吸烟者等各类患者,补充BH4对外周动脉和冠状动脉的内皮依赖性舒张功能障碍均有显著改善作用,而对内皮非依赖性舒张无显著影响。
去氧皮质醇/盐(DOCA-salt)高血压模型是一种低肾素性高血压。研究表明,该高血压模型呈现明显增强的氧化应激,BH4降低和eNOS脱耦联。有趣的是,以前的研究发现,在DOCA-salt的小鼠模型,尽管血压明显升高,由于过氧化氢(H2O2)的代偿性舒张作用,主动脉内皮依赖性血管舒张却只有轻微受损,因此尽管该文献报道口服补充BH4可以明显降低血压,其降压机制仍不明确。
结果显示:
1.给予DOCA/盐后一到三周内,野生型小鼠的血压呈时间依赖性显著增高,相对于野生型小鼠来说,GTPCH Ⅰ高表达的小鼠血压明显降低。在野生型小鼠,一周后血压已显著高于对照组(126±3 vs.105±3 mm Hg,P<0.01),而GTPCH Ⅰ高表达的小鼠三周后血压才与对照组有显著性差异,并明显低于野生型小鼠(123±4 vs.141±2 mm Hg,P<0.01)。这些结果表明内皮特异性GTPCH高表达明显抑制了血压的进展。
2.野生型高血压小鼠给予DOCA/盐三周后,肠系膜动脉超氧阴离子水平明显升高,比对照组大约增加了4倍,给予NOS抑制剂10-4 ML-NNA预孵30min明显抑制了O2-的生成,提示eNOS源性O2-的存在。另外,在GTPCH Ⅰ转基因小鼠O2-的牛成也显著降低,提示GTPCH Ⅰ高表达明显抑制了eNOS脱耦联及氧化应激水平。第二部分GTPCH Ⅰ高表达对内皮依赖性血管舒张功能的影响给予DOCA/盐三周后,小心分离三级肠系膜小动脉,放置于倒置显微镜上,用KCl预收缩血管,通过观察内皮依赖性血管舒张剂乙酰胆碱对血管直径变化的影响,探讨GTPCH对高血压时阻力血管内皮依赖性舒张功能的影响。为了探讨NO和H2O2在乙酰胆碱诱导的血管舒张中的作用,我们检测了NOS抑制剂L-NNA和H2O2灭活剂聚乙二醇过氧化氢酶(Polyethylene glycol-catalase,PEG-catalase)对乙酰胆碱舒血管作用的影响。
结果显示:
1.用10-80mM的KCl收缩肠系膜动脉,在野生型对照,野生型高血压,转基因对照和转基因高血压4组之间,收缩曲线无明显差异,50mM的KCl可引起亚最大舒张(~85%的最大舒张)。
2.10μM硝普钠诱导的内皮非依赖性血管舒张在各组间没有差异,提示平滑肌对一氧化氮的反应性是一致的。
3.在野生型DOCA/盐高血压组,10-9~10-5M乙酰胆碱诱导的内皮依赖性血管舒张与对照组相比受到明显抑制(最大舒张36.47±3.55%vs.65.264±6.18%,P<0.01),而内皮特异性高表达GTPCH Ⅰ则保持了内皮功能的完整性,与其对照组无明显差异(最大舒张66.83±3.54%vs.69.32±4.19%,P>0.05)。给予250U/ml的聚乙二醇过氧化氢酶预处理5分钟清除过氧化氢,对10-5M乙酰胆碱诱导的内皮依赖型血管舒张无影响。然而,预孵育一氧化氮合酶抑制剂300μM L-NNA 15分钟则几乎取消了10-5M乙酰胆碱诱导的血管舒张,表明乙酰胆碱诱导的内皮依赖性血管舒张在极大程度上由NO介导。
第三部分GTPCH Ⅰ高表达对肠系膜血管结构的影响通过对肠系膜动脉组织切片,苏木素/伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色,计算中膜厚度,中膜面积,中膜与管腔直径的比值来评估高血压时血管结构的变化及GTPCH Ⅰ高表达对血管结构变化的影响。细胞外基质糖蛋白Trenascin C(TN-C)是血管重塑的标志物,以往研究表明其在肺动脉高压及血管紧张素Ⅱ诱导的高血压中表达明显增加,因此我们用免疫组化法检测在DOCA/盐高血压模型TN-C的表达是否有变化及GTPCH高表达的影响。结果显示:
1.苏木苏/伊红染色显示野生型高血压小鼠的肠系膜动脉中膜明显增厚,中膜横切面面积,中膜与管腔直径的比值都显著增加,提示发生明显的肥厚性血管重塑(hypertrophic remodeling)。内皮特异性高表达GTPCH Ⅰ则抑制了这种血管重塑的发生,血管结构与对照组无显著性差异。
2.细胞外基质糖蛋白。Tenascin C在对照组小鼠和GTPCH Ⅰ转基因的高血压小鼠的肠系膜动脉只有很弱的表达或无表达,而在野生型高血压小鼠表达明显增加,阳性染色主要呈现在动脉中膜。
第四部分GTPCH Ⅰ高表达对eNOS二聚体及磷酸化的影响
分别采用低温及常温SDS-PAGE电泳及Westen blot检测小鼠主动脉eNOS二聚体/单体及磷酸化eNOS/total eNOS的比值,探讨DOCA/盐高血压及BH4对eNOS二聚体及磷酸化的影响。
结果显示:
1.各组间total eNOS的表达无差异。
2.在野生型DOCA/盐高血压小鼠,主动脉eNOS ser-1177的磷酸化与对照组相比明显降低,而GTPCH转基因的小鼠eNOS磷酸化则保持在正常水平。
3.各组间eNOS二聚体/单体比值无明显差异,提示在DOCA/盐高血压模型,GTPCH高表达对内皮功能的改善作用与eNOS二聚体的稳定性无关。
小结:
1.内皮特异性GTPCH Ⅰ高表达明显改善了高血压小鼠肠系膜阻力动脉的内皮依赖性舒张功能。
2.内皮特异性GTPCH Ⅰ高表达显著抑制了氧化应激,降低了高血压肠系膜血管超氧阴离子的产生。
3.野生型小鼠的肠系膜血管呈现明显的肥厚性血管重塑和细胞外基质糖蛋白TN—C的表达;而GTPCH Ⅰ高表达则抑制了这一过程。
4.尽管total eNOS及二聚体/单体的表达在各组间无明显差异,野生型高血压小鼠的eNOS磷酸化水平明显降低,而GTPCH Ⅰ转基因则使其维持在正常水平。
5.GTPCH Ⅰ高表达小鼠明显抑制了高血压的进展,可能与其增加eNOS活性,改善内皮依赖性血管舒张和降低血管重塑有关。
结论:
目前的研究提示,内皮特异性GTPCH Ⅰ高表达抑制了DOCA/盐小鼠的血压进展,其机制可能与维持eNOS的正常磷酸化水平及催化活性,改善肠系膜阻力血管内皮依赖性NO介导的血管舒张和血管重塑有关。通过基因转染GTPCH Ⅰ增加内源性BH4的合成可望为有效改善血管内皮功能,防治包括高血压在内的心血管疾病提供新的思路。