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目的：
探讨及分析局部晚期宫颈癌新辅助化疗患者循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA,ctDNA）基因突变与化疗反应性的关系，筛选能够用来监测或预测化疗反应性的突变基因。
方法：
1.研究设计：收集接受新辅助化疗的局部晚期宫颈癌患者化疗前后的血液标本，并前瞻性的观察患者的化疗反应性。通过比较反应性不同的患者ctDNA基因突变的差异，探讨ctDNA基因突变与化疗反应性的关系，筛选能够用于监测或预测化疗反应性的突变基因。
2.研究对象的选择：1纳入标准：原发性宫颈鳞状细胞癌患者；FIGO分期为IB2或IIA2期；诊断经病理证实；化疗前未接受过其他治疗；于我院完成2-3个周期的卡铂联合紫杉醇新辅助化疗。2排除标准：宫颈转移性癌；合并其他恶性肿瘤；外院接受化疗者。
3.化疗反应性评估：根据患者化疗前后MRI提示的肿瘤大小，按照实体瘤疗效评价标准1.1版，对新辅助化疗的疗效进行评估。按照疗效对患者进行分组，反应组包括完全缓解和部分缓解，无反应组包括疾病稳定和疾病进展。
4.循环游离DNA（circulatingcell-free DNA,cfDNA）样本及基因组DNA（genomic DNA，gDNA）样本的制备：
1)血样收取：用含EDTA的真空采血管采集患者化疗前后的外周静脉血2ml。采血后4小时内离心留取血浆并完成cfDNA的提取。
2)cfDNA提取：用QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit进行cfDNA的提取。
3)gDNA提取：用TIANamp Genomic DNA Kit进行gDNA的提取。
5.ctDNA二代测序：
1)建库：cfDNA质检合格后，采用Human Comprehensive Cancer panel(QIAGEN)，通过多重PCR的方法将cfDNA样本的160个癌症相关靶基因区域捕获下来构建文库，文库中的DNA片段通过杂交固定于flow cell的表面并通过扩增形成簇，而后进行测序。
2)测序：于Illumina的HiseqX10测序平台进行测序，平均测序深度为5000X。
6.数据分析：
每例cfDNA样本经PCR对Human Comprehensive Cancer panel(QIAGEN)中的目标基因进行靶向扩增、分离后获得ctDNA，每例ctDNA样本与配对的gDNA样本的测序数据对比分析，得到每例ctDNA对应的肿瘤特异性体细胞突变。配对比较无反应组及反应组患者化疗过程中ctDNA中突变基因及突变位点的改变，及两组患者化疗前ctDNA突变的差异，并对差异基因进行生物信息学分析，探究其与化疗反应性之间的关系。
结果：
1.一共8例宫颈鳞状细胞癌患者纳入研究。其中IB2期5例，IIA2期3例；疾病稳定或进展者5例（无反应组），完全缓解3例（反应组）。
2.配对比较同一患者化疗前后ctDNA突变，结果显示：
1)突变数目：
突变基因数目：在无反应组中，化疗后ctDNA中发生突变的基因数目减少（患者1#和4#）、增多（患者3#和5#）或变化不明显（患者2#），无明显规律；在化疗反应组中，3例患者化疗后ctDNA中发生突变的基因数目均较化疗前显著增多，化疗后突变基因数目分别为化疗前的1.92倍、1.27倍和2.17倍。
突变位点数目：在无反应组中，化疗后发生突变的位点数目减少（患者1#和4#）、增多（患者3#和5#）或变化不明显（患者2#），无明显规律；在化疗反应组中，3例患者化疗后ctDNA发生突变的位点数目均较化疗前显著增多，化疗后突变位点数目分别为化疗前的1.96倍、1.59倍和2.45倍。
2)无反应组化疗前后ctDNA突变的变化：
突变基因：ctDNA中有2个突变基因在无反应组4个患者化疗过程中共同发生了变化，为ERBB2及AKT2；有13个突变基因在无反应组3个患者化疗过程中共同发生了变化，为NOTCH1、DICER1、PBRM1、CDK12等。
突变位点：ctDNA中有1个突变位点在无反应组4个患者化疗过程中共同发生改变，对应的基因为CIC；有12个突变位点在无反应组3个患者化疗过程中共同发生改变，对应的基因为MTOR、FGFR3、EZH2等。
3)反应组化疗前后ctDNA突变的变化：
突变基因：ctDNA中有9个突变基因在反应组3个患者化疗过程中共同发生了变化，为PIK3R1、EGFR、NOTCH1、PTEN等。
突变位点：ctDNA中有2个突变位点在反应组3个患者化疗过程中共同发生了变化，对应的基因为RB1、PTEN。
4)两组患者化疗前后ctDNA突变变化的比较：
突变基因：PBRM1、CDK12基因突变在无反应组3个患者化疗过程中共同发生变化，在反应组3个患者化疗过程中无改变。PIK3R1在反应组3个患者化疗过程中发生了改变，在无反应组5个患者化疗过程中无改变。
突变位点：CIC特定位点突变在无反应组4个患者化疗过程中发生了改变，在反应组3个患者化疗过程中均无改变；MTOR、FGFR3等6个基因特定位点突变在无反应组3个患者化疗过程中发生改变，在反应组3个患者化疗过程中均无改变。RB1和PTEN特定位点突变在反应组3个患者化疗过程中发生改变，在无反应组1个患者化疗过程中也发生了改变。
3.两组患者化疗前ctDNA突变的比较
突变基因：ctDNA中MAP2K2在无反应组5个患者中出现突变，在反应组1个患者出现突变；EGFR、PTCH1、DICER1等在无反应组3~4个患者中出现突变，在反应组化疗前未出现突变；HSPH1、SMARCB1在反应组2个患者化疗前出现突变，在无反应组中无突变。
突变位点：ctDNA中AKT1、FANCD2、MAP3K1、ABL1等在无反应组3个患者化疗前出现特定位点突变，在反应组化疗前无此突变；JAK3在反应组2个患者中出现特定位点突变，在无反应组化疗前无此突变。
4.生物信息学分析
1）化疗过程中ctDNA突变分析
两组患者化疗过程中差异基因GO功能分析及KEGG pathway富集分析，显示PI3K-Akt signaling pathway、phosphatidylinositol-mediated signaling等得到显著性富集，相关基因主要为FGFR3、MTOR、PIK3R1。
差异基因PPI显示FGFR3、MTOR、PIK3R1的蛋白间具有较强的相互作用。
2）化疗前ctDNA突变分析
两组患者化疗前差异基因GO功能分析及KEGG pathway富集分析，显示PI3K-Akt signaling pathway、MAPK signaling pathway等得到显著性富集，相关基因主要为AKT1,EGFR,MAP2K2等。
差异基因PPI显示AKT1、EGFR、MAP2K2、NOTCH1等基因的蛋白之间有较强的相互作用。
结论：
局部晚期宫颈癌新辅助化疗患者ctDNA基因突变与化疗反应性密切相关。化疗过程中ctDNA发生MTOR、FGFR3、PIK3R1等基因突变的变化有希望用于监测化疗反应性，而化疗前ctDNA中AKT1、EGFR、MAP2K2的突变可能有助于预测化疗反应性；其临床应用价值还有待进一步验证。
探讨及分析局部晚期宫颈癌新辅助化疗患者循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA,ctDNA）基因突变与化疗反应性的关系，筛选能够用来监测或预测化疗反应性的突变基因。
方法：
1.研究设计：收集接受新辅助化疗的局部晚期宫颈癌患者化疗前后的血液标本，并前瞻性的观察患者的化疗反应性。通过比较反应性不同的患者ctDNA基因突变的差异，探讨ctDNA基因突变与化疗反应性的关系，筛选能够用于监测或预测化疗反应性的突变基因。
2.研究对象的选择：1纳入标准：原发性宫颈鳞状细胞癌患者；FIGO分期为IB2或IIA2期；诊断经病理证实；化疗前未接受过其他治疗；于我院完成2-3个周期的卡铂联合紫杉醇新辅助化疗。2排除标准：宫颈转移性癌；合并其他恶性肿瘤；外院接受化疗者。
3.化疗反应性评估：根据患者化疗前后MRI提示的肿瘤大小，按照实体瘤疗效评价标准1.1版，对新辅助化疗的疗效进行评估。按照疗效对患者进行分组，反应组包括完全缓解和部分缓解，无反应组包括疾病稳定和疾病进展。
4.循环游离DNA（circulatingcell-free DNA,cfDNA）样本及基因组DNA（genomic DNA，gDNA）样本的制备：
1)血样收取：用含EDTA的真空采血管采集患者化疗前后的外周静脉血2ml。采血后4小时内离心留取血浆并完成cfDNA的提取。
2)cfDNA提取：用QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit进行cfDNA的提取。
3)gDNA提取：用TIANamp Genomic DNA Kit进行gDNA的提取。
5.ctDNA二代测序：
1)建库：cfDNA质检合格后，采用Human Comprehensive Cancer panel(QIAGEN)，通过多重PCR的方法将cfDNA样本的160个癌症相关靶基因区域捕获下来构建文库，文库中的DNA片段通过杂交固定于flow cell的表面并通过扩增形成簇，而后进行测序。
2)测序：于Illumina的HiseqX10测序平台进行测序，平均测序深度为5000X。
6.数据分析：
每例cfDNA样本经PCR对Human Comprehensive Cancer panel(QIAGEN)中的目标基因进行靶向扩增、分离后获得ctDNA，每例ctDNA样本与配对的gDNA样本的测序数据对比分析，得到每例ctDNA对应的肿瘤特异性体细胞突变。配对比较无反应组及反应组患者化疗过程中ctDNA中突变基因及突变位点的改变，及两组患者化疗前ctDNA突变的差异，并对差异基因进行生物信息学分析，探究其与化疗反应性之间的关系。
结果：
1.一共8例宫颈鳞状细胞癌患者纳入研究。其中IB2期5例，IIA2期3例；疾病稳定或进展者5例（无反应组），完全缓解3例（反应组）。
2.配对比较同一患者化疗前后ctDNA突变，结果显示：
1)突变数目：
突变基因数目：在无反应组中，化疗后ctDNA中发生突变的基因数目减少（患者1#和4#）、增多（患者3#和5#）或变化不明显（患者2#），无明显规律；在化疗反应组中，3例患者化疗后ctDNA中发生突变的基因数目均较化疗前显著增多，化疗后突变基因数目分别为化疗前的1.92倍、1.27倍和2.17倍。
突变位点数目：在无反应组中，化疗后发生突变的位点数目减少（患者1#和4#）、增多（患者3#和5#）或变化不明显（患者2#），无明显规律；在化疗反应组中，3例患者化疗后ctDNA发生突变的位点数目均较化疗前显著增多，化疗后突变位点数目分别为化疗前的1.96倍、1.59倍和2.45倍。
2)无反应组化疗前后ctDNA突变的变化：
突变基因：ctDNA中有2个突变基因在无反应组4个患者化疗过程中共同发生了变化，为ERBB2及AKT2；有13个突变基因在无反应组3个患者化疗过程中共同发生了变化，为NOTCH1、DICER1、PBRM1、CDK12等。
突变位点：ctDNA中有1个突变位点在无反应组4个患者化疗过程中共同发生改变，对应的基因为CIC；有12个突变位点在无反应组3个患者化疗过程中共同发生改变，对应的基因为MTOR、FGFR3、EZH2等。
3)反应组化疗前后ctDNA突变的变化：
突变基因：ctDNA中有9个突变基因在反应组3个患者化疗过程中共同发生了变化，为PIK3R1、EGFR、NOTCH1、PTEN等。
突变位点：ctDNA中有2个突变位点在反应组3个患者化疗过程中共同发生了变化，对应的基因为RB1、PTEN。
4)两组患者化疗前后ctDNA突变变化的比较：
突变基因：PBRM1、CDK12基因突变在无反应组3个患者化疗过程中共同发生变化，在反应组3个患者化疗过程中无改变。PIK3R1在反应组3个患者化疗过程中发生了改变，在无反应组5个患者化疗过程中无改变。
突变位点：CIC特定位点突变在无反应组4个患者化疗过程中发生了改变，在反应组3个患者化疗过程中均无改变；MTOR、FGFR3等6个基因特定位点突变在无反应组3个患者化疗过程中发生改变，在反应组3个患者化疗过程中均无改变。RB1和PTEN特定位点突变在反应组3个患者化疗过程中发生改变，在无反应组1个患者化疗过程中也发生了改变。
3.两组患者化疗前ctDNA突变的比较
突变基因：ctDNA中MAP2K2在无反应组5个患者中出现突变，在反应组1个患者出现突变；EGFR、PTCH1、DICER1等在无反应组3~4个患者中出现突变，在反应组化疗前未出现突变；HSPH1、SMARCB1在反应组2个患者化疗前出现突变，在无反应组中无突变。
突变位点：ctDNA中AKT1、FANCD2、MAP3K1、ABL1等在无反应组3个患者化疗前出现特定位点突变，在反应组化疗前无此突变；JAK3在反应组2个患者中出现特定位点突变，在无反应组化疗前无此突变。
4.生物信息学分析
1）化疗过程中ctDNA突变分析
两组患者化疗过程中差异基因GO功能分析及KEGG pathway富集分析，显示PI3K-Akt signaling pathway、phosphatidylinositol-mediated signaling等得到显著性富集，相关基因主要为FGFR3、MTOR、PIK3R1。
差异基因PPI显示FGFR3、MTOR、PIK3R1的蛋白间具有较强的相互作用。
2）化疗前ctDNA突变分析
两组患者化疗前差异基因GO功能分析及KEGG pathway富集分析，显示PI3K-Akt signaling pathway、MAPK signaling pathway等得到显著性富集，相关基因主要为AKT1,EGFR,MAP2K2等。
差异基因PPI显示AKT1、EGFR、MAP2K2、NOTCH1等基因的蛋白之间有较强的相互作用。
结论：
局部晚期宫颈癌新辅助化疗患者ctDNA基因突变与化疗反应性密切相关。化疗过程中ctDNA发生MTOR、FGFR3、PIK3R1等基因突变的变化有希望用于监测化疗反应性，而化疗前ctDNA中AKT1、EGFR、MAP2K2的突变可能有助于预测化疗反应性；其临床应用价值还有待进一步验证。