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目的:用糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D(GPI-PLD)基因转染肝癌HepG2细胞,初步研究GPI-PLD基因过度表达对肝癌细胞株HepG2细胞的影响,包括对其生长及凋亡、细胞膜上糖基化磷脂酰肌醇(GPI)锚定的蛋白质释放情况等方面的影响,为肝癌的GPI-PLD基因治疗提供理论依据。方法:用脂质体转染法将本室已经构建的GPI-PLD真核表达载体pcDNA3.1(+)/GPI-PLD转入HepG2细胞,以未转染的HepG2细胞及转染空载体pcDNA3.1(+)的细胞为对照,以G418筛选出阳性细胞克隆。RT-PCR法鉴定GPI-PLD基因的mRNA表达水平,利用自制具完整GPI结构的胎盘型碱性磷酸酶(PLAP)做底物,通过曲拉通-114(TX-114)分相,定量检测GPI-PLD活性;基因转染后细胞生物学特性的观察包括MTT法检测各组细胞增殖活性,细胞计数绘制生长曲线,荧光染色观察HepG2细胞形态学改变,台盼蓝排斥法观察补体介导的细胞毒(CDC)杀伤率;运用ELISA检测GPI锚定癌胚抗原(CEA)的表达和释放情况,分光光度法检测GPI锚定PLAP的表达和释放情况。结果:1.RT-PCR结果和GPI-PLD酶活性测定表明,稳定高表达GPI-PLD的HepG2细胞系已经建立。①G418筛选后,GPI-PLD稳定转染HepG2细胞的GPI-PLD mRNA相对表达量较转染空质粒组和未转染组明显增高,差异有显著性(P<0.05),各组细胞GPI-PLDmRNA的相对表达量用积分分光密度比值(IA比值)表示,分别为0.926±0.124、0.164±0.057和0.205±0.045。②GPI-PLD稳定转染HepG2细胞后,GPI-PLD活性较转染空质粒组和未转染组明显增高,差异有显著性意义(P<0.01),各组细胞的GPI-PLD活性(%)分别为13.4±4.44、4.82±2.99和6.52±2.34。③GPI-PLD转染HepG2细胞后,GPI锚定的蛋白质如CEA、PLAP等被GPI-PLD水解释放入培养基,GPI-PLD转染组细胞培养基上清CEA浓度较其他两组明显增高,具有显著性差异(P<0.01),超声粉碎细胞上清和细胞培养基上清PLAP的活性测定,转染空质粒组和未转染细胞组PLAP活性主要分布于超声粉碎细胞上清液中,而GPI-PLD转染组细胞PLAP活性绝大部分分布于细胞培养液。2.GPI-PLD基因过度表达对HepG2细胞有影响。①GPI-PLD稳定转染HepG2细胞后,GPI-PLD转染组较转染空质粒组和未转染组细胞增殖能力明显减弱。②GPI-PLD稳定转染HepG2细胞后,较转染空质粒组和未转染组细胞对补体杀伤的敏感性增强,具有显著性差异(P<0.01),各组细胞的杀伤率(%)分别为16.4±2.10、5.7±1.15、5.9±1.39。③GPI-PLD稳定转染HepG2细胞后,呈现典型的凋亡细胞形态特征。结论:1.成功将GPI-PLD基因转染入HepG2细胞,并在细胞中稳定表达。2.本试验证实GPI-PLD基因有抗肿瘤的作用。即通过上调GPI-PLD活性,释放GPI锚定蛋白,增强肿瘤细胞对补体杀伤的敏感性,促进肿瘤细胞的凋亡,抑制肿瘤细胞的增殖。本试验为肿瘤GPI-PLD基因治疗奠定了理论与实验基础。