论文部分内容阅读
近年来，CD19 CAR-T（ChimericantigenreceptorT-cell）细胞疗法在部分难治或复发性 B细胞恶性肿瘤中展现出里程碑式的疗效，但是目前大部分基础和临床研究中使用的CD19 CAR-T细胞均由病毒载体制备而来。尽管此类病毒载体相对高效，但是其生产、检测流程复杂且成本高昂，此外也存在向CAR-T细胞产品中引入具有复制能力的病毒等风险。上述缺陷在一定程度上限制了这类CAR-T疗法在临床上的广泛应用，因此临床上尚需更好的CAR-T制备载体。大量研究表明，基于piggyBac（PB）转座子系统的非病毒类载体具有替代病毒载体的潜力。在前期的研究中，我们构建了一种基于PB转座子的新型整合系统，相比于目前大部分的二元PB转座子系统，我们在同一个质粒载体中整合了PB表达框和外源基因表达框，使得该载体具有更大的外源基因负载能力和更高的整合效率。为了研究基于PB转座子新型整合系统在B细胞恶性治疗中的应用前景，我们研究了基于该载体制备而来的CD19 CAR-T在体内外的抗肿瘤活性。
首先，通过流式检测CAR-T细胞表面CAR分子的表达情况，我们证明了PB转座子整合系统的高效性，在制备CAR-T时具有不弱于病毒载体的整合效率。随后我们对 CAR-T细胞亚群和记忆表型等进行了检测，结果表明，相比病毒系统而言，基于PB转座子系统的CD19 CAR-T中具有更高比例的CD8+T细胞。更为重要的是，该转座子来源的CD19 CAR-T中具有更高比例的中央记忆T细胞（TCM），而这类细胞往往与远期抗肿瘤活性密切相关。此外，我们也通过检测CD19 CAR-T细胞培养上清中的多种细胞因子分泌水平，对CAR-T细胞功能进行了评估。相比于病毒系统，基于PB转座子新型整合系统的CD19 CAR-T在接受靶抗原刺激后，细胞培养上清中TNF-α的水平更高而具有免疫抑制作用的IL-10的水平相对更低。随后借助DELFIA（Dissociation-enhanced lanthanide fluorescent immunoassay）细胞杀伤实验，我们研究了CD19 CAR-T对靶细胞的裂解活性。结果表明，两种载体制备的CD19 CAR-T对靶细胞都有较强的裂解活性。此外，我们还借助小鼠成瘤模型，对比了两种载体制备的CD19 CAR-T在体内的抗肿瘤活性。结果表明，基于本PB转座子系统的CD19 CAR-T在小鼠体内也拥有良好的抗肿瘤活性，与病毒载体来源的CD19 CAR-T抗肿瘤活性相似。并且在治疗过程中，小鼠体重并未出现明显下降，这也侧面印证了该疗法在体内的安全性。最后，通过非限制性内切酶线性介导的PCR（Nonrestrictive linear amplification–mediated PCR，nrLAM-PCR）以及高通量测序，我们对基于本PB转座子整合系统的CD19 CAR-T细胞样本进行了全基因组整合位点的分析。整体结果表明，我们开发的非病毒载体潜在致癌风险较低、安全性较好。
尽管CD19 CAR-T比传统化疗等治疗手段抗肿瘤效果更加显著，但是仍然存在不少难治或复发性 B细胞恶性肿瘤患者对该疗法没有响应，这在一定程度上归咎于抑制性的肿瘤微环境。通过进一步改造 CAR-T细胞进而使其能够分泌靶向 PD-1（Programmed cell death-1 receptor）的抗体，或许能进一步提升CAR-T的疗效。目前此类研究中CAR-T细胞分泌的抗体结构多为单链抗体（Single chain variable fragment，scFv），由于 scFv表达量较低和稳定性相对较差等原因，我们认为来源于骆驼科动物中分子量更小且结构更加稳定的纳米抗体或许更适合用于CAR-T细胞分泌型抗体的研究。因此在证明了基于本PB转座子系统CD19 CAR-T在体内外均具有良好的抗肿瘤活性后，我们通过免疫羊驼和噬菌体展示技术快速筛选得到了一个靶向PD-1的纳米抗体h3E3。通过ELISA和流式细胞术实验，我们证明了h3E3和PD-1有较高的亲和力，能够有效阻断PD-1和PD-L1的结合，并且特异性良好。此外，竞争ELISA法的结果表明，h3E3和市售PD-1抗体Keytruda具有较为相似的结合表位，这提示二者或许拥有相似的功能活性。借助报告基因实验，我们也进一步证明了h3E3能够通过结合细胞表面的 PD-1受体的方式，引起 PD-1下游抑制信号的解除，说明h3E3具备良好的功能活性，能够在后续的应用中起到免疫检查点阻断剂的功能。最后基于相同的PB转座子整合系统，我们构建了分泌h3E3纳米抗体的CD19 CAR-T。通过ELISA定量法检测CAR-T细胞培养上清中的h3E3分泌水平，我们证明了h3E3纳米抗体能够在本系统中持续稳定地表达和分泌，并且 h3E3能够有效封闭 CAR-T细胞表面的PD-1。最后，在利用DELFIA对过表达PD-L1肿瘤细胞株杀伤实验中，我们也证明了分泌h3E3纳米抗体的CD19 CAR-T也展现出了比单独的CD19 CAR-T更强的杀伤活性。
综上所述，我们成功构建了基于PB转座子新型整合系统的CD19 CAR-T，并通过相关体内外实验证明了其拥有良好的抗肿瘤活性和安全性。此外，基于相同的转座子系统，我们也初步证明了通过向 CAR-T细胞中引入自分泌型 PD-1纳米抗体的方式，能进一步增强CD19 CAR-T的抗肿瘤活性。更为重要的是，相比于病毒载体而言，PB转座子基于质粒的载体系统拥有更加简便的制备流程和工艺，其成本远远低于病毒载体。而纳米抗体由于拥有分子量小和结构稳定等优势，在肿瘤局部或许拥有更强的组织渗透性和更持久的功能活性。因此我们相信，在综合利用PB转座子整合系统和纳米抗体各自优势的情况下，通过构建自分泌纳米抗体CAR-T这种方式，或许能进一步拓展多种CAR-T在血液瘤乃至实体瘤中的适用范围和应用前景，本课题也为将来相关基础和临床研究提供了重要参考。
首先，通过流式检测CAR-T细胞表面CAR分子的表达情况，我们证明了PB转座子整合系统的高效性，在制备CAR-T时具有不弱于病毒载体的整合效率。随后我们对 CAR-T细胞亚群和记忆表型等进行了检测，结果表明，相比病毒系统而言，基于PB转座子系统的CD19 CAR-T中具有更高比例的CD8+T细胞。更为重要的是，该转座子来源的CD19 CAR-T中具有更高比例的中央记忆T细胞（TCM），而这类细胞往往与远期抗肿瘤活性密切相关。此外，我们也通过检测CD19 CAR-T细胞培养上清中的多种细胞因子分泌水平，对CAR-T细胞功能进行了评估。相比于病毒系统，基于PB转座子新型整合系统的CD19 CAR-T在接受靶抗原刺激后，细胞培养上清中TNF-α的水平更高而具有免疫抑制作用的IL-10的水平相对更低。随后借助DELFIA（Dissociation-enhanced lanthanide fluorescent immunoassay）细胞杀伤实验，我们研究了CD19 CAR-T对靶细胞的裂解活性。结果表明，两种载体制备的CD19 CAR-T对靶细胞都有较强的裂解活性。此外，我们还借助小鼠成瘤模型，对比了两种载体制备的CD19 CAR-T在体内的抗肿瘤活性。结果表明，基于本PB转座子系统的CD19 CAR-T在小鼠体内也拥有良好的抗肿瘤活性，与病毒载体来源的CD19 CAR-T抗肿瘤活性相似。并且在治疗过程中，小鼠体重并未出现明显下降，这也侧面印证了该疗法在体内的安全性。最后，通过非限制性内切酶线性介导的PCR（Nonrestrictive linear amplification–mediated PCR，nrLAM-PCR）以及高通量测序，我们对基于本PB转座子整合系统的CD19 CAR-T细胞样本进行了全基因组整合位点的分析。整体结果表明，我们开发的非病毒载体潜在致癌风险较低、安全性较好。
尽管CD19 CAR-T比传统化疗等治疗手段抗肿瘤效果更加显著，但是仍然存在不少难治或复发性 B细胞恶性肿瘤患者对该疗法没有响应，这在一定程度上归咎于抑制性的肿瘤微环境。通过进一步改造 CAR-T细胞进而使其能够分泌靶向 PD-1（Programmed cell death-1 receptor）的抗体，或许能进一步提升CAR-T的疗效。目前此类研究中CAR-T细胞分泌的抗体结构多为单链抗体（Single chain variable fragment，scFv），由于 scFv表达量较低和稳定性相对较差等原因，我们认为来源于骆驼科动物中分子量更小且结构更加稳定的纳米抗体或许更适合用于CAR-T细胞分泌型抗体的研究。因此在证明了基于本PB转座子系统CD19 CAR-T在体内外均具有良好的抗肿瘤活性后，我们通过免疫羊驼和噬菌体展示技术快速筛选得到了一个靶向PD-1的纳米抗体h3E3。通过ELISA和流式细胞术实验，我们证明了h3E3和PD-1有较高的亲和力，能够有效阻断PD-1和PD-L1的结合，并且特异性良好。此外，竞争ELISA法的结果表明，h3E3和市售PD-1抗体Keytruda具有较为相似的结合表位，这提示二者或许拥有相似的功能活性。借助报告基因实验，我们也进一步证明了h3E3能够通过结合细胞表面的 PD-1受体的方式，引起 PD-1下游抑制信号的解除，说明h3E3具备良好的功能活性，能够在后续的应用中起到免疫检查点阻断剂的功能。最后基于相同的PB转座子整合系统，我们构建了分泌h3E3纳米抗体的CD19 CAR-T。通过ELISA定量法检测CAR-T细胞培养上清中的h3E3分泌水平，我们证明了h3E3纳米抗体能够在本系统中持续稳定地表达和分泌，并且 h3E3能够有效封闭 CAR-T细胞表面的PD-1。最后，在利用DELFIA对过表达PD-L1肿瘤细胞株杀伤实验中，我们也证明了分泌h3E3纳米抗体的CD19 CAR-T也展现出了比单独的CD19 CAR-T更强的杀伤活性。
综上所述，我们成功构建了基于PB转座子新型整合系统的CD19 CAR-T，并通过相关体内外实验证明了其拥有良好的抗肿瘤活性和安全性。此外，基于相同的转座子系统，我们也初步证明了通过向 CAR-T细胞中引入自分泌型 PD-1纳米抗体的方式，能进一步增强CD19 CAR-T的抗肿瘤活性。更为重要的是，相比于病毒载体而言，PB转座子基于质粒的载体系统拥有更加简便的制备流程和工艺，其成本远远低于病毒载体。而纳米抗体由于拥有分子量小和结构稳定等优势，在肿瘤局部或许拥有更强的组织渗透性和更持久的功能活性。因此我们相信，在综合利用PB转座子整合系统和纳米抗体各自优势的情况下，通过构建自分泌纳米抗体CAR-T这种方式，或许能进一步拓展多种CAR-T在血液瘤乃至实体瘤中的适用范围和应用前景，本课题也为将来相关基础和临床研究提供了重要参考。