猪巨细胞病毒(porcine cytomegalovirus,PCMV)感染会导致猪巨细胞病毒病,主要引起仔猪的肺炎、鼻炎。PCMV是一种条件性病原微生物,引起的疾病容易误诊误治。且随着养猪业的发展,该病有蔓延趋势,对其进行分子流行病学病学调查,了解感染率和流行规律,对猪巨细胞病毒病研究和防控有重要实践意义。多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)是引起禽霍乱(Fowl Cholera)的病原菌,是造成养禽业经济损失的主要病原之一。目前,对多杀性巴氏杆菌的研究,多集中在分离、鉴定和药敏试验等临床应用领域,而从全基因组对其宿主偏好性、抗原、抗菌药物临床使用效果的稳定性等方面的研究较少。因此,对多杀性巴氏杆菌分离株的全基因组测定、分析,了解其致病性和耐药机理、宿主偏好性等具有重要的理论和实际意义。1、PCMV分子流行病学调查本课题根据Gen Bank中登录的PCMV糖蛋白B(glycoprotein B,g B)基因序列,设计2对特异性引物,对江西省PCMV进行了分子流行病学调查,并对g B序列进行了生物信息学分析。我们对送检的169份哺乳仔猪和保育猪病料进行检测,共有12份病料为阳性,阳性率7.1%,说明PCMV在病死猪中感染率较低,且多集中在呼吸道症状较明显的病死猪中。2、g B序列分析克隆了2份猪g B全长基因序列(JX＿1和JX＿2),测序结果显示序列长2580bp,与Gen Bank中登录的PCMV g B序列相似性超过99%;生物信息学分析表明,PCMV分为2个进化分支,JX＿1与国内部分分离株位于同一进化分支,JX＿2与国外分离株处于同一进化分支,这两条g B序列的核苷酸与氨基酸序列存在多个位点的变异,JX＿1株的核苷酸序列在1130-1133位置上缺失3个核苷酸,有8个核苷酸变异和5个氨基酸变异;进化分析表明PCMV与人的疱疹病毒位于同一个进化分支上。3、禽多杀性巴氏杆菌的分离鉴定我们对送检的疑似禽霍乱的病死鸭、鸡进行病原菌的分离、鉴定及药敏试验,并根据结果选择敏感药物进行临床治疗。从病死鸭、鸡肝脏中各分离得到1株细菌,经鉴定分离菌为多杀性巴氏杆菌。将分离菌分别命名为:Pm-jx-01(鸭)和Pm-jx-02(鸡)。Pm-jx-01株对大观霉素、氟苯尼考和氨苄西林高度敏感,对甲硝唑、头孢曲松、头孢噻肟、阿莫西林、复方新诺明、链霉素耐药;Pm-jx-02株对恩诺沙星、青霉素、头孢噻肟、阿莫西林、氧氟沙星和头孢曲松高度敏感,对氨苄西林、复方新诺明、氟苯尼考、土霉素、丁胺卡那耐药。4、禽多杀性巴氏杆菌全基因组测定及分析采用第三代DNA测序技术,对Pmjx-01和Pm-jx-02进行全基因组序列测定拼接。Pm-jx-01全基因组长2,302,632bp,GC含量为40.35%,共有2117个编码基因;Pm-jx-02全基因组长2,321,968 bp,GC含量为40.42%,共有2099个编码基因;仅Pm-jx-01株有编码参与机体多细胞过程的蛋白基因。2株分离菌的毒力因子多达279-280种,Pm-jx-01株染色体上有6类10个耐药基因:氨基糖苷类(ant3ia、aph33ib、aph3ia、aph6id)、β-内酰胺酶(bl2d＿oxa1)、氯霉素类(cata11)、磺胺类(sul2、sul3)、四环素类(tetb)和大环内脂类(mef B),其中染色体中的ICE-1中就包含5个耐药基因;Pm-jx-02株只有2类2个耐药基因:氯霉素类(cata11),四环素类(tetb);结合药敏试验结果可知,Pm-jx-01株产生耐药性的主要原因是其基因组中存在编码的耐药基因,而Pm-jx-02株的耐药基因并非是其主要的耐药机制。比较基因组学显示,Pm-jx-02株染色体共有600个基因簇,单拷贝基因数量达1257个,特有基因113个。水平转移元件分析表明,Pm-jx-01株存在1个ICE-1和4个IS元件,且有编码细菌素(bacteriocin)和黏附蛋白(LAP)2种次级代谢产物的基因,插入-整合子序列集中在基因组的1350K-1400K之间,Pm-jx-02只有1个IS元件、1个特有基因和未知功能的次级代谢产物,插入-整合子序列散布于整个基因组。对12株Pm进行泛基因组学分析,发现随着测序基因组数目的增加,泛基因组大小也呈快速上升趋势,但核心基因组则呈下降趋势,这表明多杀性巴氏杆菌基因组应是开放型泛基因组,获得外源基因的能力很强;Pm-jx-01株的泛基因组数目和核心基因组要比Pm-jx-02株多,可推测Pm-jx-01株比Pm-jx-02株容易变异。本试验对江西省猪场PCMV进行了初步分子流行病学调查,并对2株临床分离的Pm进行药敏试验,全基因组序列测定、分析和注释,以期为了解猪群PCMV感染和防控措施提供数据支撑,同时为研究禽巴氏杆菌耐药、致病和变异机理等提供进一步研究思路。