论文部分内容阅读
粉防己碱(Tetrandrine,TET)是从中草药粉防己(Stephania tetrandra)的根块中提取的双苄基异喹啉类生物碱。TET具有广泛的药理学作用,如抗风湿、抗炎和抗高血压等。TET还具有抗肿瘤活性,可显著性增强肿瘤细胞的放疗和化疗敏感性。已有研究表明TET诱导肿瘤细胞周期阻滞和细胞凋亡,但其作用机制到目前为止还不完全清楚。本研究的目的是阐明TET诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡的分子机制及信号调节通路,从而为TET的临床应用提供更深入的理论依据和治疗方案。1.TET抑制结肠癌细胞生长并诱导G1期阻滞和细胞凋亡(1)HT-29细胞以不同浓度TET分别作用不同时间,生长抑制实验和细胞活力检测结果表明TET抑制肿瘤细胞生长,且呈浓度依赖性和时间依赖性。HCT116细胞以不同浓度TET作用18h,TET可明显抑制细胞的生长,并呈浓度依赖性。(2)30μM TET作用HT-29细胞12h,细胞形态发生明显改变如细胞变小变圆,一些细胞从培养瓶壁上脱落下来;24h出现核固缩和凋亡小体等明显凋亡征象。30μM TET作用HCT116细胞12h也出现变小变圆的类似改变。(3)细胞周期分析结果显示,TET(10-30μM)可将HT-29和HCT116细胞周期阻滞在G1期。30μM TET作用24h后,可出现明显的sub-G1凋亡峰。2.TET对PI3K/AKT/GSK3β通路的作用(1)Western blot结果显示,TET导致细胞周期阻滞及凋亡的作用与TET诱导细胞周期和凋亡调节蛋白的变化有关,它可以降低AKT、磷酸化AKT(Ser473)、cyclinD1、procaspase 3、磷酸化GSK3β(Ser9)的表达,同时增加GSK3β、磷酸化cyclin D1(Thr286)的表达,诱导caspase 3的活化和PARP的裂解。(2)TET可增加HT-29细胞p27kip1的表达,并呈浓度和时间依赖性,这可能与TET诱导的G1期阻滞和凋亡有关。(3)由于TET可降低结肠癌细胞中cyclin D1的蛋白水平,因此我们对cyclin D1表达降低的机制进行了更深一步的研究。我们发现蛋白酶抑制剂MG132(5μM)可以逆转TET引起的cyclin D1蛋白的降低,这说明在结肠癌细胞中TET在蛋白水平促进cyclin D1的水解。(4)有研究报道GSK3β的胞核内定位与其活化有关,因此我们通过间接免疫荧光染色法检测了TET是否对GSK3β的细胞内分布有影响。结果显示30μM TET作用12h,HT-29细胞中的GSK3β在细胞质和细胞核中都有分布,而在对照细胞中,GSK3β只在细胞质中表达,说明TET促使GSK3β由胞质向胞核移位。(5)为了进一步分析TET引起的AKT抑制与GSK3β活化的关系及AKT抑制与GSK3β活化对细胞周期和细胞凋亡调节蛋白的影响,我们给予AKT抑制剂wortmannin和LY294002或者转染外源性野生型GSK3β质粒,观察这两种处理对HT-29细胞的作用及周期阻滞和凋亡相关蛋白表达变化。结果显示AKT抑制剂降低了GSK3βSer9位磷酸化水平,表明AKT是GSK3β的上游(AKT抑制可引起GSK3β活化)。Wortmannin也下调cyclinD1并诱导caspase 3的活化和PARP的裂解。同样地,转染外源性GSK3β也增加cyclin D1(Thr286)磷酸化水平,下调cyclinD1并诱导了PARP的裂解。(6)为确定GSK3β活化在TET诱导G1期阻滞和细胞凋亡中的作用,我们应用了GSK3β抑制剂LiCl(30mM)和SB216763(30μM)以及RNA干扰剂GSK3βsiRNA。LiCl、SB216763和GSK3βsiRNA都减弱了TET所致G1期阻滞和细胞凋亡调节蛋白的变化,即抑制cyclinD1下调、caspase3的活化和PARP的裂解。细胞周期分析和细胞凋亡检测进一步确定了GSK3β活化在TET诱导G1期阻滞和细胞凋亡的作用。30μMTET作用18h后G1期细胞的百分比增加,而S期和G2/M期比例相应下降,同时出现了小的亚G1期(sub-G1)凋亡峰和少量坏死细胞。同时给予LiCl、SB216763或转染GSK3βsiRNA可抑制TET单独作用所致的G1期阻滞。Annexin-V/PI双染和TUNEL荧光染色结果表明GSK3βsiRNA可逆转TET所致的细胞凋亡。而且,转染外源性野生型GSK3β质粒同样导致G1期阻滞和亚G1期出现,说明GSK3β活化足以导致细胞G1期阻滞和细胞凋亡。(7)为了解GSK3β下游caspase 3的活化在TET诱导细胞凋亡中的作用,我们运用了一种caspase3抑制剂Ac-DEVD-CHO。蛋白电泳表明Ac-DEVD-CHO可阻断caspase 3的活化和PARP的裂解。Annexin-V/PI染色表明Ac-DEVD-CHO可逆转TET所致的细胞凋亡,表明TET可通过激活caspase 3诱导细胞凋亡。3.TET对MAPK通路的影响为研究MAPK通路与TET作用的关系,我们也检测了30μM TET分别作用不同时间引起MAPK表达变化。在HT-29细胞中,Western blot结果显示磷酸化(活化)的JNK和p38的表达随时间增加逐渐增强,但磷酸化(活化)的ERK1/2表达降低;同样在HCT116细胞中我们也发现TET增加磷酸化JNK和p38的表达,但磷酸化ERK1/2的表达下降,说明在这两种细胞中TET激活了JNK和p38但抑制ERK1/2,可能参与TET诱导的周期阻滞及细胞凋亡。4.TET对其他相关蛋白的影响我们还分析TET对其他相关蛋白如EGFR、NF-κB、mdm2和survivin的影响。我们发现TET可诱导这些蛋白的下调。5.TET对蛋白酶体通路的影响为了解蛋白酶体与TET作用的关系,我们使用蛋白酶体抑制剂MG132,发现预先给予MG132可逆转TET单独作用所致的G1阻滞。RT-PCR检测发现TET可促进蛋白酶体通路酶E1、E2、E3的mRNA表达上调。结论:综上所述,我们的研究证明有多种信号通路参与了TET诱导的细胞G1期阻滞和细胞凋亡的调节。(1)PI3K/AKT/GSK3β信号通路与TET诱导G1期阻滞和细胞凋亡有关,GSK3β活化在这些过程中起重要作用:(2)TET诱导的G1期阻滞与cyclinD1磷酸化水平增高导致cyclinD1泛素化和水解增多有关;(3)TET诱导的细胞凋亡与caspase 3和其底物PARP的断裂活化有关;(4)TET诱导GSK3β的胞核转移和p27kip1上调;(5)TET诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡可能还与ERK1/2的磷酸化水平下降、NF-κB和mdm2的下调有关。