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烟草花叶病毒属于烟草花叶病毒属,寄主范围十分广泛,茄科、十字花科、禾本科、藜科、豆科等许多植物都能被其侵染,给农业经济作物带来了严重的危害。选育抗病品种是控制该病的主要措施之一,但对其相关抗病基因的分离鉴定和功能挖掘应用仍需加强研究。HIN1（Harpin-induced gene 1）是Harpin诱导表达的蛋白之一,在多种植物防卫反应、生长发育、衰老以及抗逆过程中都发挥着重要功能,明确该基因在抗烟草花叶病毒的功能对于防治病毒病有重要的理论和实际意义。本研究通过分子克隆技术从本氏烟、辣椒、马铃薯和番茄四种茄科植物中分离得到Hin1基因,通过生物信息学工具对DNA序列及其编码的蛋白序列进行分析;明确烟草NtHin1的亚细胞定位情况和组织表达水平,并成功构建了植物表达载体pFGC5941-NtHin1,通过农杆菌介导法和遗传转化方法得到了超表达NtHin1的本氏烟草,并在此基础上进行了抗烟草花叶病毒的功能鉴定,最后通过转录组测序,探求其抗病毒作用机理。本研究克隆得到4种茄科植物的Hin1基因:烟草NtHin1为687 bp、辣椒CaHin1为684 bp、马铃薯StHin1为675 bp、番茄SlHin1为675bp。W聚类分析表明NtHin1与CaHin1的氨基酸序列同源性最高为89.9%,进化树结果表明茄科植物之间亲缘关系最近,拟南芥次之,与水稻、高粱单子叶植物的亲缘关系较远。蛋白预测结果表明NtHIN1编码229个氨基酸,蛋白的理论分子量为26.2kD,理论等电点为9.39,分子式为C1182H1840N320O327S13,具有保守结构域LEA-14。通过构建RFP融合表达载体pCV-NtHin1,利用农杆菌侵染转化的表达方法使其在本氏烟叶片中瞬时表达,激光共聚焦显微镜下观察表明融合NtHIN1定位在细胞膜上。Real time-PCR表明,NtHin1基因在本氏烟草各个组织中均有表达,且相对表达量由高到低依次为根>花>叶>茎。根据NtHin1序列成功构建了植物表达载体pFGC5941-NtHin1,在本氏烟中瞬时表达后再接种TMV-GFP,经过观察荧光扩展情况发现接毒4天后,处理组的本氏烟叶片并未出现肉眼可见的绿色荧光而对照组叶片已经出现明显的绿色荧光。处理组在第5天出现了可见的绿色荧光斑点,而此时对照组的绿色荧光已经扩展到本氏烟心叶。直到第7天,处理组的零星荧光仅有略微的扩大,而对照组的绿色荧光已扩散至所有心叶;ELISA的结果也证明在接种7天后对照组病毒复制量达到处理组的7倍。随后利用农杆菌介导法转化烟草叶盘,获得阳性遗传转化植株,T0代植株对烟草花叶病毒的抑制效果也和瞬时表达结果一致。经过阳性筛选后得到T1代的遗传转化阳性植株,它在形态学上和野生型并没有明显的差异,也并未出现过敏性坏死斑点。通过摩擦接种TMV-GFP后,在第2天就出现了肉眼可见的绿色荧光斑点,相比之下对照组的斑点数多于处理组。接种后第3天斑点开始变大并开始扩散,第4天时对照组已经扩展到整片心叶而处理组则还未扩展到心叶,处理组的绿色荧光斑点也相对较少,通过荧光定量PCR检测TMV含量也间接证明病毒RNA水平的积累量显著低于对照组。综上结果表明超表达NtHin1会对烟草花叶病毒有一定的抑制作用。通过比较野生型和T0代遗传转化植株的转录组数据,发现了102条差异表达的基因,其中48条上调,54条下调。它们参与了植物体内多种的生理生化过程,包括植物与病原菌的互作、植物激素信号转导、内吞作用、RNA降解等多达23个不同的通路。通过实时荧光定量PCR的验证后我们发现烟草PARN、CNGCs、Rab11基因在处理组和对照组均上调表达,经过茉莉酸处理之后,本氏烟中Hin1和Rab11分别在5h和2h开始上调,在5-12h两个基因的变化趋势是基本一致的,并且遗传转化植株中茉莉酸途径的受体基因COI1有着更高的表达水平,暗示着诱导了茉莉酸的生物合成途径。但是蛋白互作的试验证明NtRAB11和NtHIN1之间并没有存在直接的互作关系,它们之间具体的关系还需要进一步研究。