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目的: 以补骨脂、黄芩、天南星、双黄连冻干粉为研究对象,联合人胎盘屏障体外模型应用PA-1细胞评价药物的胚胎毒性,并以补骨脂为示范研究对象,以p-PBPK模型为基础,联合PA-1细胞建立补骨脂的量-毒关系,共同评价补骨脂的胚胎毒性,建立一种将体外研究结果外推到人体的系统方法,为建立符合中医药特点的中药胚胎毒性筛查体系奠定基础,为妊娠期应用中药的安全性研究搭建良好的平台。 方法: 1、分别制备中药补骨脂、黄芩、天南星、双黄连冻干粉受试物,体外培养PA-1细胞,采用不同浓度的受试物进行干预,培养24h后MTS法检测PA-1细胞存活率,分析药物对PA-1细胞增殖的影响。根据细胞存活率计算结果确定中药无胚胎毒性、IC50、显著胚胎毒性的浓度,设置包含三者在内的浓度梯度,分别加入人胎盘屏障体外模型母体池进行灌流研究。 2、采用人胎盘组织薄片培养技术结合 Ussing 扩散池法建立人胎盘屏障体外模型。将设置好的不同浓度的补骨脂、黄芩、天南星、双黄连冻干粉受试物加入模型母体池,于加药后10min、30min、60min、90min、120min、150min、180min采集胎儿池灌流液,应用MTS法检测胎儿池灌流液对PA-1细胞增殖的影响。 3、以补骨脂为示范,建立p-PBPK模型,应用Matlab/Simulink 仿真系统对整体模型进行仿真模拟,了解补骨脂在妊娠期女性体内的分布过程,将胎儿单元的药时曲线转换成药代动力学参数,计算出补骨脂在妊娠期女性胎儿单元的药物浓度。 4、联合体外PA-1细胞毒性数据与p-PBPK模型模拟的补骨脂在胎儿单元的药代动力学参数共同推导补骨脂透过人胎盘屏障的药物浓度关系方程,根据方程计算补骨脂透过人胎盘屏障造成胎儿宫内暴露的药物浓度,并与模拟的补骨脂在妊娠期女性体内胎儿单元的药物浓度进行对比,共同评价补骨脂的胚胎毒性。 结果: 1、补骨脂浓度为25mg/ml时PA-1细胞存活率为93.09±4.67%,说明对PA-1细胞的增殖无影响,在人胎盘屏障体外模型灌流10min-180min胎儿池蓄积的补骨脂作用于PA-1细胞的存活率均>90%,说明灌流10min-180min内胎儿池蓄积的补骨脂对PA-1细胞的增殖无影响;补骨脂浓度为50mg/ml时PA-1细胞存活率为69.45±7.12%,说明对PA-1细胞的增殖有影响,在人胎盘屏障体外模型灌流10min-180min胎儿池蓄积的补骨脂作用于PA-1细胞的存活率均>90%,说明灌流10min-180min内胎儿池蓄积的补骨脂对PA-1细胞增殖无影响;补骨脂浓度为100mg/ml时PA-1细胞存活率为44.70±6.17%,说明对PA-1细胞的增殖有影响,在人胎盘屏障体外模型灌流10min-30min胎儿池蓄积的补骨脂作用于PA-1细胞的存活率均>90%,灌流时间增加至60min-180min胎儿池蓄积的补骨脂作用于PA-1细胞的存活率均<90%,说明灌流30min内胎儿池蓄积的补骨脂对PA-1细胞的增殖无影响,灌流时间增加至60min-180min对PA-1细胞的增殖有影响;补骨脂浓度为200mg/ml、400mg/ml时PA-1细胞存活率分别为33.24±9.23%、19.86 ±6.82%,说明对PA-1细胞的增殖有影响,在人胎盘屏障体外模型灌流10min胎儿池蓄积的补骨脂作用于PA-1细胞的存活率均>90%,灌流时间增加至30min-180min胎儿池蓄积的补骨脂作用于PA-1细胞的存活率均<90%,说明两种浓度灌流10min内胎儿池蓄积的补骨脂对PA-1细胞的增殖无影响,灌流时间增加至30min-180min对PA-1细胞的增殖有影响;补骨脂浓度为800mg/ml时PA-1细胞存活率为5.62±2.31%,说明对PA-1细胞的增殖有影响,在人胎盘屏障体外模型灌流10min胎儿池蓄积的补骨脂作用于PA-1细胞的存活率>90%,灌流时间增加至30min胎儿池蓄积的补骨脂作用于PA-1细胞的存活率<90%,至60min时细胞的存活率<10%,说明灌流10min胎儿池蓄积的补骨脂对PA-1细胞的增殖无影响,灌流时间增加至30min对PA-1细胞的增殖有影响,灌流时间增加至60min对PA-1细胞的增殖有显著影响,随着灌流时间增加对PA-1细胞增殖的影响增加。 2、黄芩浓度为18.75mg/ml时PA-1细胞存活率为94.56±2.21%,说明对PA-1细胞的增殖无影响,在人胎盘屏障体外模型灌流10min-180min胎儿池蓄积的黄芩作用于PA-1细胞的存活率均>90%,说明灌流180min内胎儿池蓄积的黄芩对PA-1细胞的增殖无影响;黄芩浓度为37.5mg/ml、75mg/ml时PA-1细胞存活率分别为83.58±1.69%、67.04 ±2.12%,说明对PA-1细胞的增殖有影响,在人胎盘屏障体外模型灌流10min-180min胎儿池蓄积的黄芩作用于PA-1细胞的存活率均>90%,说明两种浓度灌流180min内胎儿池蓄积的黄芩对PA-1细胞的增殖无影响;黄芩浓度为150mg/ml时PA-1细胞存活率为 62.19 ± 1.95%,说明对 PA-1 细胞的增殖有影响,在人胎盘屏障体外模型灌流10min-120min胎儿池蓄积的黄芩作用于PA-1细胞的存活率均>90%,灌流时间增加至150min-180min 胎儿池蓄积的黄芩作用于 PA-1 细胞的存活率均<90%,说明灌流10min-120min 胎儿池蓄积的黄芩对 PA-1 细胞增殖无影响,灌流时间增加至150min-180min对PA-1细胞增殖有影响;黄芩浓度为300mg/ml、600mg/ml时PA-1细胞存活率分别为54.8±3.42%、33.53±2.29%,说明对PA-1细胞的增殖有影响,在人胎盘屏障体外模型灌流10min-30min均>90%,灌流时间增加至60min-180min胎儿池蓄积的黄芩作用于PA-1细胞的存活率均<90%,说明两种浓度灌流10min-30min胎儿池蓄积的黄芩对PA-1细胞增殖无影响,灌流时间增加至60min-180minPA-1细胞增殖有影响;黄芩浓度为900mg/ml、1200mg/ml时PA-1细胞存活率分别为23.92±4.86%、16.38± 5.06%,说明对PA-1细胞的增殖有影响,在人胎盘屏障体外模型灌流10min胎儿池蓄积的黄芩作用于PA-1细胞的存活率均>90%,灌流时间增加至30min-180min胎儿池蓄积的黄芩作用于PA-1细胞的存活率均<90%,说明,灌流10min胎儿池蓄积的黄芩对PA-1细胞增殖无影响,灌流时间增加至30min-180min对PA-1细胞增殖有影响,随着灌流时间增加对PA-1细胞增殖的影响增加。 3、天南星浓度为12.5mg/ml时PA-1细胞存活率为95.11±1.47%,说明对PA-1细胞的增殖无影响,在人胎盘屏障体外模型灌流10min-180min胎儿池蓄积的天南星作用于PA-1细胞的存活率均>90%,说明灌流180min内胎儿池蓄积的天南星对PA-1细胞增殖无影响;天南星浓度为25mg/ml、50mg/ml时PA-1细胞存活率分别为71.3±10.21%、50.23 ± 3.92%,说明对 PA-1 细胞的增殖有影响,在人胎盘屏障体外模型灌流10min-180min胎儿池蓄积的天南星作用于PA-1细胞的存活率均>90%,说明两种浓度灌流180min内胎儿池蓄积的天南星对PA-1细胞增殖无影响;天南星浓度为100mg/ml、200mg/ml、400mg/ml时PA-1细胞存活率分别为26.66±3.79%、16.58±5.05%、6.57± 4.00%,说明对PA-1细胞的增殖有影响,在人胎盘屏障体外模型灌流10min胎儿池蓄积的天南星作用于PA-1细胞的存活率均>90%,胎儿池蓄积的天南星作用于PA-1细胞的存活率均>90%,灌流时间增加至60min-180min胎儿池蓄积的天南星作用于PA-1细胞的存活率均<90%,说明三种浓度灌流10min胎儿池蓄积的天南星对PA-1细胞增殖无影响,灌流时间增加至30min-180min对PA-1细胞增殖有影响,随着灌流时间增加对PA-1细胞增殖的影响增加。 4、双黄连冻干粉浓度为0.2mg/ml时PA-1细胞存活率为94.28±1.62%,说明对PA-1细胞的增殖无影响,在人胎盘屏障体外模型灌流10min-180min胎儿池蓄积的双黄连冻干粉作用于PA-1细胞的存活率均>90%,说明灌流180min内胎儿池蓄积的双黄连冻干粉对PA-1细胞增殖无影响;双黄连冻干粉浓度为0.4mg/ml、0.8mg/ml时PA-1细胞存活率为83.9±3.52%、77.4±4.98%,说明对PA-1细胞的增殖有影响,在人胎盘屏障体外模型灌流10min-180min胎儿池蓄积的双黄连冻干粉作用于PA-1细胞的存活率均>90%,说明两种浓度灌流180min内胎儿池蓄积的双黄连冻干粉对PA-1细胞增殖无影响;双黄连冻干粉浓度为1.6mg/ml、3.2mg/ml时PA-1细胞存活率为66.75±2.91%、45.25±4.68%,说明对PA-1细胞的增殖有影响,在人胎盘屏障体外模型灌流10min胎儿池蓄积的双黄连冻干粉作用于PA-1细胞的存活率均>90%,灌流时间增加至60min-180min胎儿池蓄积的双黄连冻干粉作用于PA-1细胞的存活率均<90%,说明两种浓度灌流10min胎儿池蓄积的双黄连冻干粉对PA-1细胞增殖无影响,灌流时间增加至30min-180min对PA-1细胞增殖有影响;双黄连冻干粉浓度为6.4mg/ml时PA-1细胞存活率为27.31±2.38%,说明对PA-1细胞的增殖有影响,在人胎盘屏障体外模型灌流10min-180min胎儿池蓄积的双黄连冻干粉作用于PA-1细胞的存活率分别为均<90%,说明灌流10min-180min胎儿池蓄积的双黄连冻干粉对PA-1细胞增殖有影响;双黄连冻干粉浓度为12.8mg/ml时PA-1细胞存活率为8.73±0.25%,说明对PA-1细胞的增殖有显著影响,在人胎盘屏障体外模型灌流10min-30min胎儿池蓄积的双黄连冻干粉作用于PA-1细胞的存活率均<90%,灌流时间增加至60min-180min胎儿池蓄积的双黄连冻干粉作用于PA-1细胞的存活率均<20%,说明灌流10min-30min胎儿池蓄积的双黄连冻干粉对PA-1细胞增殖有影响,灌流时间增加至60min-180min对PA-1细胞增殖有显著影响,随着灌流时间增加对PA-1细胞增殖的影响增加。 5、妊娠期服用补骨脂主要分布在机体静脉、肝脏、心脏、肾脏、肺脏、胎儿单元等组织器官,其浓度由大到小为静脉>肝脏>心脏>肾脏>肺脏>胎儿单元。补骨脂在胎儿单元的药代动力学参数为 t1/2=44.32min , tmax=88.64min , F=2.25%, CL=0.012L/min/kg,Total AUC=31461 ng/mL/min,Cmax=87.58ng/ml,MRT=215.22min,说明与机体内其它组织器官相比补骨脂在胎儿单元达峰时间稍晚,蓄积量较小。 6、根据本研究中p-PBPK模型属于血流限速模型特征、各组织中补骨脂的药时曲线特征以及胎儿单元药代动力学参数,推导方程Cf=Cm×F,其中Cf为胎儿池浓度,Cm为母体池浓度,F为生物利用度,可通过此方程计算补骨脂透过人胎盘屏障在胎儿池蓄积的补骨脂浓度; 7、当补骨脂浓度分别为25mg/ml、50mg/ml、100mg/ml、200mg/ml、400mg/ml、800mg/ml时,透过人胎盘屏障180min胎儿宫内暴露的补骨脂浓度分别为0.56mg/ml、1.13mg/ml、2.25mg/ml、4.50mg/ml、9.00mg/ml、18.00mg/ml,其浓度约为母体池补骨脂弄的2%。妊娠期口服补骨脂10g 胎儿体内的补骨脂浓度以胎儿单元药时曲线180min内的曲线下面积表示,计算结果为0.01mg/ml。 结论: 1、补骨脂、黄芩、天南星、双黄连冻干粉最大的无胚胎毒性浓度分别为50mg/ml、75mg/ml、50mg/ml、0.8mg/ml,最小的致胚胎毒性浓度分别为100mg/ml、150mg/ml、100mg/ml、1.6mg/ml。中药是否致胚胎毒性与药物浓度和透过胎盘屏障造成胎儿宫内暴露的时间有关,浓度高暴露时间长时对胎儿影响大。 2、补骨脂在妊娠期女性体内药代动力学过程的最佳房室模型为一室模型,次最佳房室模型为二室模型。 3、补骨脂透过人胎盘屏障造成胎儿宫内暴露的浓度远远低于母体侧药物浓度,通过p-PBPK模型应用PA-1细胞研究表明妊娠期服用临床剂量的补骨脂可能无胚胎毒性。 4、基于p-PBPK模型应用PA-1细胞可以对中药的胚胎毒性进行定性定量研究,从而建立一种将体外研究结果外推到人体的系统方法,为建立符合中医药特点的中药胚胎毒性筛查体系奠定了基础,为妊娠期应用中药的安全性研究搭建了一个良好的平台。