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目的:正常细胞的功能维持依赖于细胞内精细的物质运输体系,相较于正常细胞,肿瘤细胞内物质代谢、信号传导更活跃。细胞质动力蛋白是细胞内物质运输的一个重要载体,是由多个亚基组成的分子量较大的复合物,其主要功能为沿着微管向微管负端进行长距离细胞内物质运输,以及有丝分裂过程中核膜破裂、纺锤体组装、染色体运动等。既往研究显示其功能异常可导致肿瘤发生,并且在肿瘤发展过程中,细胞质动力蛋白可以与某些促癌蛋白协同作用促进肿瘤增殖、转移。DYNC1I1是细胞质动力蛋白的重要货物结合亚基,其在肿瘤中的作用存在争议。早期研究发现其在肝细胞癌中表达增加,但最近研究显示在脑胶质瘤中其表达下调,抑制肿瘤进展,高表达DYNC1I1脑胶质瘤患者预后较好。目前对DYNC1I1在肿瘤中的作用研究有限,在胃癌中尚无报道。我们前期在线数据分析表明DYNC1I1是胃癌预后不良因素,但在胃癌中的作用及机制并不明确。在这里,我们主要研究DYNC1I1在胃癌中的作用及其潜在机制。材料与方法:1.利用MTT法测定细胞活性。2.利用ELISA检测细胞上清液中IL-6的浓度。3.利用eBioscienceTMAnnexin V-FITC凋亡试剂盒检测细胞凋亡。4.利用ACTIVE MOTIFTM试剂盒提取细胞核蛋白。5.利用Western Blot检测蛋白表达。6.利用免疫荧光技术检测P65,P-P65等蛋白的表达及细胞内分布情况。7.利用Lipofectamine 2000试剂进行瞬时siRNA或质粒转染,下调目标蛋白的表达。8.动物实验建立裸鼠胃癌皮下成瘤及尾静脉肺转移模型,研究沉默DYNC1I1表达对胃癌皮下成瘤及肺转移病灶的抑制作用。9.利用RT-qPCR检测DYNC1I1、IL-6、TNPO2等基因mRNA的表达情况。10.Affymetrix sanner 3000芯片检测细胞基因表达谱水平。11.利用集落形成实验检测沉默DYNC1I1后对胃癌细胞增殖的长期抑制作用。12.利用碘化丙啶（Propidium Iodide PI）单染流式细胞术检测细胞周期。13.利用免疫共沉淀法分析蛋白复合物的形成。14.采用Gene Expression Omnibus（GEO）在线数据库分析DYNC1I1表达与胃癌病理学参数相关性,DYNC1I1表达与胃癌预后的关系。15.统计学处理:每次实验结果重复3次,数据以均值±标准差（±S）表示。采用SPSS 17.0统计分析软件进行统计学分析。各组间比较采用t检验,P<0.05具有统计学意义。结果:1、高DYNC1I1表达的胃癌患者预后不良。在NCBI的GEO数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）下载胃癌数据集GSE62254用于研究DYNC1I1临床价值。根据DYNC1I1基因表达将数据分为高DYNC1I1表达和低DYNC1I1表达组。卡方检验用于确定DYNC1I1表达与胃癌临床病理特征之间的关系。分析显示DYNC1I1表达与胃癌侵袭深度,淋巴结状态和临床（TNM）分期相关。单因素及多因素COX分析显示DYNC1I1是胃癌的独立预后危险因素。根据DYNC1I1表达水平分析了胃癌患者的总生存期（OS）,发现高DYNC1I1表达的胃癌患者具有较短的生存期（P<0.001）。多因素Cox分析显示,DYNC1I1是胃癌的独立预后危险因素（P<0.05）。这些数据表明高DYNC1I1表达胃癌分期较晚,并且高DYNC1I1表达胃癌患者预后不良。2、DYNC1I1在体外促进胃癌细胞的增殖和迁移。Western blot测定了6种胃癌细胞系及正常胃细胞GES-1中DYNC1I1蛋白的表达水平。与正常胃细胞GES-1相比,在胃癌细胞中观察到更高的表达。本研究选择表达较高的胃癌细胞系HGC-27、SGC-7901。MTT和集落形成实验评估DYNC1I1对细胞增殖的影响。与对照组相比,沉默DYNC1I1后抑制胃癌细胞增殖。集落实验证明沉默DYNC1I1后对胃癌细胞的长期增殖抑制更明显。Transwell结果显示沉默DYNC1I1后明显抑制胃癌细胞迁移,与同期增殖相比迁移抑制率明显增大,DYNC1I1抑制胃癌细胞迁移并不是由于抑制增殖所致。这些体外实验证明,DYNC1I1的敲低抑制了胃癌细胞的增殖和迁移。3、DYNC1I1促进裸鼠体内胃癌增殖和转移。将转染有沉默DYNC1I1慢病毒（KD-DYNC1I1）的SGC-7901细胞及转染无用序列（NC-DYNC1I1）的SGC-7901细胞注射入裸鼠皮下,沉默DYNC1I1组比对照产生体积更小的皮下肿瘤。免疫组化显示沉默DYNC1I1组中Ki-67（增殖标记物）的水平显著降低。将同样处理的SGC-7901细胞尾静脉注射到小鼠体内来检测DYNC1I1在体内肿瘤转移中的作用。在尾静脉注射肿瘤细胞后9周处死小鼠检查肺是否存在转移结节及转移结节数目。与对照组相比,注射SGC-7901 KD-DYNC1I1细胞的小鼠肺转移结节明显减少。免疫组织化学染色显示,与对照组肿瘤相比,沉默DYNC1I1组肿瘤中DYNC1I1和Ki-67的表达水平显著降低。这些数据表明沉默DYNC1I1后可以抑制体内肿瘤的增殖和转移。4、DYNC1I1上调IL-6发挥功能。在cBioPortal for Cancer Genomics网站下载胃腺癌数据库。筛选与DYNC1I1表达正相关并且Spearman系数大于或等于0.3的基因。然后使用DAVID网站进行通路分析。GO分析显示变化倍数最大的前5个并且P<0.05的通路包括IL-6-Jak-STAT signaling pathway,与细胞增殖和迁移显著相关的通路。应用HGC-27细胞系在沉默DYNC1I1后进行Affymetrix sanner表达谱芯片检测。对下调的基因进行GO分析,排名前5的通路包括“Negative regulation of interleukin-6 secretion”。表明IL-6可能在DYNC1I1介导的胃癌细胞增殖和迁移中起关键作用。ELISA测定结果显示沉默DYNC1I1后上清液中的IL-6蛋白水平明显降低。蛋白质印迹显示,在沉默DYNC1I1表达后,磷酸化STAT3（其是经典的IL-6下游靶标）也显著下调,但STAT3变化并不明显。这些结果表明,DYNC1I1可能通过调节IL-6的水平来调节胃癌细胞的生物学行为,并且IL-6-Jak-STAT途径可能参与DYNC1I1对胃癌细胞增殖和迁移的调节。5、DYNC1I1通过上调IL-6促进胃癌细胞的增殖和迁移。在对照组细胞中添加IL-6中和抗体显著抑制胃癌细胞增殖（60%）。相反,在沉默DYNC1I1组细胞中添加重组人IL-6因子逆转了由沉默DYNC1I1导致的细胞增殖抑制。在沉默DYNC1I1后加入重组人IL-6细胞迁移能力上调。免疫组织化学染色显示在小鼠皮下肿瘤和肺转移结节中沉默DYNC1I1组的小鼠肿瘤组织IL-6表达下调。总之,这些结果表明,DYNC1I1通过上调IL-6来促进胃癌细胞的增殖和迁移。6、DYNC1I1通过促进NF-κB核转运来上调IL-6的表达。RT-qPCR结果显示沉默DYNC1I1后IL-6 mRNA水平显著降低。使用GeneCard网站（GeneCards-Human Genes|Gene Database|Gene Search）预测IL-6转录因子,排在首位的转录因子是NF-κB。核浆分离结果显示沉默DYNC1I1导致p65转位至细胞核中的量减少,无论是本底及其磷酸化水平。免疫荧光实验进一步证实p65在胃癌细胞内的分布。免疫共沉淀显示P65与DYNC1I1结合。基于这些结果,得到结论DYNC1I1可能通过促进P65核转位来上调IL-6转录。另外还检测了沉默DYNC1I1后DYNC1I1本身在胃癌细胞中的分布,DYNC1I1在细胞核中的表达没有显著变化,但其在细胞质中的表达下调,这说明沉默DYNC1I1后可能影响其在胞浆中的作用,因为DYNC1I1在细胞质中的作用主要是将货物长距离向微管负端运输,推测是否在沉默DYNC1I1后主要影响其作为运输载体的功能。总之,这些结果显示DYNC1I1通过促进胃癌细胞中的p65核转位来上调IL-6表达水平。7、DYNC1I1上调胃癌细胞TNPO2表达。为探讨DYNC1I1在胃癌中促进细胞增殖转移的具体机制,用Affymetrix sanner表达谱芯片检测在HGC-27细胞中沉默DYNC1I1后mRNA表达的差异。结果发现与对照组相比,沉默DYNC1I1后下调最明显的前10位基因中TNPO2表达明显下调,达29.55倍。接着在SGC-7901、HGC-27细胞中沉默DYNC1I1后分别应用RT-PCR,Western blot检测TNPO2 mRNA和蛋白水平变化,沉默DYNC1I1后无论在mRNA水平还是蛋白水平TNPO2均下调,且均有统计学意义。8、高TNPO2表达的胃癌患者预后不良。为了阐明TNPO2在胃癌中的作用,在GEPIA网站检测了TNPO2在胃癌及癌旁表达水平,胃癌中的表达明显高于癌旁。KM-Plotter数据库对不同TNPO2表达水平的胃癌患者进行生存分析,结果发现高表达TNPO2的胃癌患者预后较差。这些结果说明高TNPO2表达的胃癌患者预后不良。9、TNPO2促进胃癌细胞增殖。为了评估TNPO2在胃癌细胞中的生物学功能,应用siRNA瞬时沉默TNPO2表达,MTT检测显示沉默TNPO2后胃癌细胞增殖能力明显下调。流式细胞术检测沉默TNPO2后细胞周期水平变化。实验结果显示与对照组相比在沉默TNPO2 48小时后细胞周期阻滞在G1期。10、DYNC1I1下调转录因子SP1下调TNPO2表达。首先通过PROMO网站预测TNPO2转录因子。同时在genecard网站预测TNPO2转录因子,排在首位的为SP1,其包含在PROMO网站预测的结果中。推测SP1在DYNC1I1调控TNPO2表达中起重要作用。应用RT-qPCR及Western Blot检测在沉默DYNC1I1后SP1 mRNA及蛋白水平变化,在沉默DYNC1I1后SP1 mRNA和蛋白水平均下调。沉默SP1后检测TNPO2蛋白水平变化,结果显示沉默SP1后胃癌细胞中的TNPO2在蛋白水平下调。这些结果证明在胃癌细胞中DYNC1I1通过调控TNPO2转录因子SP1的表达从而调控TNPO2表达。结论:1.高DYNC1I1表达胃癌患者预后不良,DYNC1I1是胃癌的独立预后不良因素;2、DYNC1I1通过促进P65核转位上调IL-6表达从而促进胃癌细胞在体内体外增殖、转移;3、DYNC1I1通过上调转录因子SP1上调TNPO2表达;4、TNPO2促进胃癌细胞增殖。