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【研究目的】
肠神经系统(ENS)是机体最大的外周神经系统，胃肠道的大部分生理功能受ENS调控，包括运动和感觉功能。虽然大多数ENS的细胞蓝图在出生时就已确定，但肠道神经网络功能的成熟是在肠道微生物和黏膜免疫系统的影响下，在生后肠道微环境内完成的。越来越多的证据表明肠道微生物对局部和系统神经的发育和功能成熟均有显著影响。此外，胃肠道平滑肌层广泛存在着两种特殊的间质细胞Cajal间质细胞(ICCs)和PDGFRα+细胞，参与形成慢波节律，传递来自肠神经元的信号，与ENS协调一致共同调控胃肠道运动功能。本研究以抗生素诱导的肠道菌群紊乱幼年鼠为研究对象，通过评估小鼠胃肠动力、外周5-HT水平以及ENS和间质细胞形态结构变化，探究肠道微生物影响胃肠动力的内在机制，以期为临床预防和治疗功能性胃肠病提供新的思路。
【研究方法】
1.建立动物模型，检测肠动力：3-4周龄Balb/c小鼠随机分为对照组和抗生素组，每组10只，分别给予抗生素混合物(氨苄青霉素100mg/kg、万古霉素50mg/kg、甲硝唑100mg/kg、新霉素100mg/kg和两性霉素B1mg/kg)或无菌水灌胃处理1次/12h，连续处理2周，然后分别通过16SrRNA分析粪便菌群结构变化；胃肠道传输时间(GITT)、排珠时间评估肠动力，从整体上评估抗生素处理对小鼠肠道微生物结构以及胃肠动力的影响。
2.评估肠道菌群紊乱后结肠ENS及间质细胞形态结构变化：制作结肠分层铺片标本，通过免疫荧光观察S100β标记的肠神经胶质细胞、nNOS标记的氮能神经元、ChAT标记的胆碱能神经元、c-kit标记的ICCs以及PDGFRα标记的PDGFRα＋细胞；提取结肠肌层组织蛋白，通过Westernblot检测肠神经胶质细胞标志蛋白S100β、氮能神经元标志蛋白nNOS、胆碱能神经元标志蛋白ChAT、ICCs标志蛋白c-kit以及PDGFRα＋细胞标志蛋白PDGFRα的表达水平，从组织水平观察抗生素诱导的肠道菌群紊乱对结肠ENS相关细胞及间质细胞形态结构的影响。
3.检测5-HT和5-HT4受体的变化及MOS干预效果：收集小鼠外周血清和结肠组织上清，通过Elisa检测血清和组织5-HT水平；制作近端结肠石蜡切片，通过免疫组织化学观察5-HT4受体在结肠肌层的分布情况；提取结肠肌层组织蛋白，通过Westernblot检测结肠肌层5-HT4受体表达水平，探究肠道菌群紊乱对5-HT的生物合成及结肠肌层5-HT4受体表达的影响。随后增设抗生素处理亚组，从抗生素干预第7天开始额外给予MOS(Mosapride citrate)1mg·kg-1·day-1至第14天。通过GITT、排珠实验评估胃肠动力；通过肌动扫描仪检测结肠环体外蠕动收缩反应，探究MOS是否可以减轻抗生素诱导的肠道运动功能紊乱。
【研究结果】
1.小鼠经过两周抗生素处理后，肠道菌群丰度和多样性明显降低，盲肠体积和质量明显增加，胃肠道和结肠传输时间明显延长，排便频率降低，表明抗生素处理导致小鼠肠道菌群结构发生改变，胃肠动力受损。
2.免疫荧光和Westernblot结果显示抗生素处理后小鼠结肠ENS形态结构发生改变：肌间神经丛肠神经胶质细胞密度增加，氮能神经元数目减少；结肠肌层ICCs密度增加。
3.Elisa结果显示抗生素处理后小鼠外周血清和结肠组织5-HT水平降低，表明抗生素诱导的肠道菌群紊乱干扰了小鼠外周5-HT的生物合成；免疫组化和Westernblot结果显示抗生素诱导肠道菌群后小鼠结肠肌层5-HT4受体表达水平相对升高；GITT和排珠实验结果显示：补充MOS可明显缩短抗生素处理小鼠胃肠道和结肠传输时间，结肠环体外蠕动收缩结果显示：补充MOS明显改善抗生素处理小鼠结肠蠕动收缩的频率和幅度，表明MOS可以改善抗生素诱导的小鼠肠道运动功能紊乱。
【研究结论】
抗生素诱导的肠道菌群紊乱可以干扰宿主5-HT生物合成，导致幼年小鼠胃肠动力受损，结肠ENS和间质细胞形态结构发生改变，补充5-HT4受体激动剂MOS可减轻抗生素诱导的小鼠胃肠动力紊乱。研究结果提示肠道菌群在塑造幼年小鼠ENS和间质细胞结构完善及功能成熟方面发挥着重要作用，并且这种作用可能是通过调节5-HT4受体信号通路实现的。
肠神经系统(ENS)是机体最大的外周神经系统，胃肠道的大部分生理功能受ENS调控，包括运动和感觉功能。虽然大多数ENS的细胞蓝图在出生时就已确定，但肠道神经网络功能的成熟是在肠道微生物和黏膜免疫系统的影响下，在生后肠道微环境内完成的。越来越多的证据表明肠道微生物对局部和系统神经的发育和功能成熟均有显著影响。此外，胃肠道平滑肌层广泛存在着两种特殊的间质细胞Cajal间质细胞(ICCs)和PDGFRα+细胞，参与形成慢波节律，传递来自肠神经元的信号，与ENS协调一致共同调控胃肠道运动功能。本研究以抗生素诱导的肠道菌群紊乱幼年鼠为研究对象，通过评估小鼠胃肠动力、外周5-HT水平以及ENS和间质细胞形态结构变化，探究肠道微生物影响胃肠动力的内在机制，以期为临床预防和治疗功能性胃肠病提供新的思路。
【研究方法】
1.建立动物模型，检测肠动力：3-4周龄Balb/c小鼠随机分为对照组和抗生素组，每组10只，分别给予抗生素混合物(氨苄青霉素100mg/kg、万古霉素50mg/kg、甲硝唑100mg/kg、新霉素100mg/kg和两性霉素B1mg/kg)或无菌水灌胃处理1次/12h，连续处理2周，然后分别通过16SrRNA分析粪便菌群结构变化；胃肠道传输时间(GITT)、排珠时间评估肠动力，从整体上评估抗生素处理对小鼠肠道微生物结构以及胃肠动力的影响。
2.评估肠道菌群紊乱后结肠ENS及间质细胞形态结构变化：制作结肠分层铺片标本，通过免疫荧光观察S100β标记的肠神经胶质细胞、nNOS标记的氮能神经元、ChAT标记的胆碱能神经元、c-kit标记的ICCs以及PDGFRα标记的PDGFRα＋细胞；提取结肠肌层组织蛋白，通过Westernblot检测肠神经胶质细胞标志蛋白S100β、氮能神经元标志蛋白nNOS、胆碱能神经元标志蛋白ChAT、ICCs标志蛋白c-kit以及PDGFRα＋细胞标志蛋白PDGFRα的表达水平，从组织水平观察抗生素诱导的肠道菌群紊乱对结肠ENS相关细胞及间质细胞形态结构的影响。
3.检测5-HT和5-HT4受体的变化及MOS干预效果：收集小鼠外周血清和结肠组织上清，通过Elisa检测血清和组织5-HT水平；制作近端结肠石蜡切片，通过免疫组织化学观察5-HT4受体在结肠肌层的分布情况；提取结肠肌层组织蛋白，通过Westernblot检测结肠肌层5-HT4受体表达水平，探究肠道菌群紊乱对5-HT的生物合成及结肠肌层5-HT4受体表达的影响。随后增设抗生素处理亚组，从抗生素干预第7天开始额外给予MOS(Mosapride citrate)1mg·kg-1·day-1至第14天。通过GITT、排珠实验评估胃肠动力；通过肌动扫描仪检测结肠环体外蠕动收缩反应，探究MOS是否可以减轻抗生素诱导的肠道运动功能紊乱。
【研究结果】
1.小鼠经过两周抗生素处理后，肠道菌群丰度和多样性明显降低，盲肠体积和质量明显增加，胃肠道和结肠传输时间明显延长，排便频率降低，表明抗生素处理导致小鼠肠道菌群结构发生改变，胃肠动力受损。
2.免疫荧光和Westernblot结果显示抗生素处理后小鼠结肠ENS形态结构发生改变：肌间神经丛肠神经胶质细胞密度增加，氮能神经元数目减少；结肠肌层ICCs密度增加。
3.Elisa结果显示抗生素处理后小鼠外周血清和结肠组织5-HT水平降低，表明抗生素诱导的肠道菌群紊乱干扰了小鼠外周5-HT的生物合成；免疫组化和Westernblot结果显示抗生素诱导肠道菌群后小鼠结肠肌层5-HT4受体表达水平相对升高；GITT和排珠实验结果显示：补充MOS可明显缩短抗生素处理小鼠胃肠道和结肠传输时间，结肠环体外蠕动收缩结果显示：补充MOS明显改善抗生素处理小鼠结肠蠕动收缩的频率和幅度，表明MOS可以改善抗生素诱导的小鼠肠道运动功能紊乱。
【研究结论】
抗生素诱导的肠道菌群紊乱可以干扰宿主5-HT生物合成，导致幼年小鼠胃肠动力受损，结肠ENS和间质细胞形态结构发生改变，补充5-HT4受体激动剂MOS可减轻抗生素诱导的小鼠胃肠动力紊乱。研究结果提示肠道菌群在塑造幼年小鼠ENS和间质细胞结构完善及功能成熟方面发挥着重要作用，并且这种作用可能是通过调节5-HT4受体信号通路实现的。