相关背景:新生儿坏死性小肠结肠炎（necrotizing enterocolitis,NEC）是一种好发于早产儿的严重消化系统疾病。截止目前,人们对NEC的发生机理仍不十分了解,但认为许多因素参与其中。目前的临床研究已发现:早产、缺血缺氧、人工喂养、喂养不当、感染、肠道微生物菌群异位定植等,为NEC发病的主要高危因素。由于NEC发病机制不明,部分患儿起病隐匿,且缺乏较为有效的预防手段。目前的治疗主要是发病后的对症治疗,包括禁食、抗感染、及手术治疗等。导致目前NEC的预后差、病死率高。母乳喂养（breastfeeding）被证实对NEC的预防有确切效果,但具体机制尚不清楚。母乳中含有丰富的外泌体,富含生物反应调节因子,如蛋白、脂类、microRNA等,这些外泌体可能对新生儿肠道上皮有保护作用,从而遏制NEC的发生。本研究拟对母乳外泌体的功能展开研究,并对其进行microRNA的芯片测序,将高表达的microRNA分离出来进一步研究,对其肠道上皮的保护机制进行探讨,以期为NEC的防治找到新的靶标及治疗方案。第一部分早产儿与足月儿母乳外泌体蛋白含量分析研究目的:对母乳外泌体进行分离及鉴定并分析早产儿与足月儿母乳外泌体蛋白含量差异。方法:收集早产儿及足月儿母亲乳汁,利用人类体液外泌体分离试剂盒（Human Body Fluid Exosome Isolation kit）对母乳外泌体进行分离,用电子显微镜对其形态进行观察,并用纳米颗粒分析仪对分离到的外泌体粒径分布进行分析。用蛋白电泳印记法（Western-blot）对外泌体特征性四分子跨膜蛋白CD63及CD81进行检测,采用人肠道上皮细胞Caco2及NCM460作为阴性对照。用二辛可宁酸（bicinchonininc acid,BCA）法对早产儿及足月儿母亲母乳外泌体的蛋白含量进行检测及对比分析。结果:共收集54份母乳样本,其中33份来自足月儿母亲,21份来自早产儿母亲。按照外泌体试剂盒操作手册进行外泌体分离纯化,电镜下观察到囊泡样结构,粒径分布在70～150nm之间,用Western-blot电泳证实分离出的囊泡表达外泌体特征性四分子跨膜蛋白CD63及CD81。BCA蛋白测定结果示足月儿母亲与早产儿母亲乳汁中的外泌体蛋白含量相当,差异无统计学意义（p＞0.05）。结论:乳汁含有丰富的外泌体,可以用试剂盒分离检测到,且无需用传统的梯度离心法来分离,更加省时省力。从目前采集到的母乳样本分析的结果来看,足月儿和早产儿母亲母乳外泌体蛋白的含量无显著差异。第二部分母乳外泌体对新生儿坏死性小肠结肠炎肠道上皮屏障完整性的保护作用研究目的:利用母乳外泌体预处理细胞及动物后,再进行NEC造模,探讨其对细胞及动物NEC模型上皮紧密连接蛋白ZO1、claudin1和occludin的保护作用。方法:在细胞实验部分:分别将人结肠腺癌细胞Caco2和人正常结肠上皮细胞NCM460,随机分成5组:（1）无特殊处置的空白对照组;（2）仅添加母乳外泌体的外泌体组;（3）LPS刺激组;（4）外泌体预处理后+LPS处理组以及（5）去外泌体母乳预处理后加LPS处理组。十二小时后,用rt-qPCR及Western-blot对各组细胞的紧密连接蛋白ZO1、claudin1及occludin进行检测,在其mRNA表达水平及蛋白表达水平进行各组间的比较。动物实验部分:把100只出生日龄4天的C57/BL6小鼠随机分成4组,每组25只,分别为:（1）母乳喂养对照组;（2）NEC模型组;（3）母乳外泌体预处理后的NEC模型组及（4）不含母乳外泌体的乳汁预处理后的NEC模型组。NEC的模型采用“高渗奶粉喂养+缺氧+LPS”联合刺激的方式诱导建立。诱导96小时后建模完成,对小鼠在造模期间的死亡率,体重变化情况及对幸存的小鼠血清中炎性因子IL-1β及TNF-α浓度及回肠样本上皮紧密连接蛋白claudin1、occludin及ZO1的表达水平及翻译水平进行后续比较分析。结果:①细胞实验部分,经过母乳外泌体预处理6小时后再进行LPS刺激的肠道上皮细胞,无论是Caco2还是NCM460,在转录水平上其紧密连接蛋白的相对表达倍数均显著高于LPS单纯刺激组的细胞（p＜0.05）及不含母乳外泌体乳汁预处理后LPS刺激组的细胞（p＜0.05）,而与单加外泌体组及空白对照组相似。在蛋白翻译水平,经Western blot检测,经过母乳外泌体预处理6小时后再进行LPS刺激的肠道上皮细胞,其肠道上皮紧密连接蛋白的丰度显著高于LPS单纯刺激组的细胞及不含母乳外泌体预处理后LPS刺激组的细胞（p＜0.05）,而与单纯加母乳外泌体预处理的细胞及空白对照组细胞相似。②动物实验部分,经过人母乳外泌体预处理过后再诱导NEC的小鼠,在肠道病理损伤程度显著低于未经外泌体预处理的NEC模型小鼠及不含外泌体母乳预处理的NEC模型小鼠（p＜0.05）。经Western blot测试,对小肠上皮紧密连接蛋白的翻译水平显示,外泌体组+NEC造模组小鼠的肠道上皮紧密连接蛋白claudin1、occludin及ZO1的含量都明显高于NEC模型组及不含外泌体的母乳预处理组+NEC造模组（p＜0.05）,而与母乳喂养空白对照组相当。用免疫荧光对老鼠肠道上皮的紧密连接蛋白claudin1进行染色,发现母乳外泌体预处理+NEC模型组的小鼠claudin1的荧光强度明显强于单纯NEC造模组及不含外泌体母乳预处理+NEC造模组,甚至略强于母乳喂养组（p＜0.05）。在造模期间（96小时）,母乳喂养组小鼠平均存活时间为92.8±4.6h,母乳外泌体组+NEC造模组的小鼠平均存活时间为82.5±2.7h,单纯NEC造模组的小鼠平均存活时间为72.8±6.5h,不含外泌体母乳干预组+NEC造模组的小鼠平均存活时间为74.9±9.2h。在体重增幅方面,母乳喂养组小鼠平均增重为2.1±0.42g,母乳外泌体组+NEC造模组的小鼠平均增重为0.9±0.23g,单纯NEC造模组的小鼠平均增重为-0.97±0.26g,不含外泌体母乳干预组+NEC造模组的小鼠平均增重则为-0.88±0.17g。在炎性因子含量方面,母乳外泌体预处理+NEC造模组小鼠的IL-1β及TNF-α的含量分别为0.85±0.33pg/ml及18.22±4.4pg/ml,显著低于单纯NEC造模组及不含外泌体母乳干预组+NEC造模组小鼠（p＜0.05）,而与母乳喂养组相当。结论:母乳外泌体可以保护肠道上皮紧密连接蛋白claudin1、occludin及ZO1不被LPS破坏,降低小鼠血清中炎性因子IL-1β及TNF-α的水平,发挥维持肠道上皮完整性及抑制炎症的作用,从而预防NEC的发生。第三部分母乳外泌体源miR-145-5p防护新生儿坏死性小肠结肠炎机制的研究目的:寻找母乳外泌体差异表达miRNA,并对选中的miRNA进行下游的靶基因预测及功能验证,从而探索该miRNA在NEC预防中的作用。方法:①分别取4份母乳外泌体样本及4份不含母乳外泌体乳汁样本,利用Illumina二代测序平台对其中miRNA进行测序,并进行差异表达分析。根据p＜0.05及|logFC|＞1（差异表达倍数）的原则,最终选出在母乳外泌体中上调差异最明显的miRNA作为研究对象。根据前期的动物模型研究验证,发现在这些差异最明显的miRNA中,miR-145-5p对小鼠肠道上皮保护作用最明显。所以决定对该条miRNA及其下游的靶基因组开展研究。根据生物信息学分析,使用三大miRNA数据库TarBase、Targetscan和Mirdb对其进行下游靶基因预测,对三数据库系统的预测结果取交集,对所获得的靶基因组采用GO及KEGG富集分析,利用String网站对这些基因构建蛋白共表达互作网络,根据共表达评分,选出分值最高的靶基因（结果为TLR4）,进行miRNA与该条靶基因之间互作关系的研究。②将小鼠随机分为两组,每组20只,组1为NEC模型组,组2为母乳喂养组,造模结束后,对肠道组织进行取材,分别对组织中的miR-145-5p及TLR4的表达水平进行rt-qPCR检测,并进行比较。分别构建 miR-145-5p 过表达（Over expression）,沉默（inhibition）及空载（vector）组慢病毒,根据分组对肠道上皮细胞Caco2和NCM460细胞进行转染。根据不同的干预,分为5组（1）空载对照组（vector）;（2）miR-145-5p过表达（OE）+LPS刺激组;（3）miRNS-145-5p沉默（inhibition）+LPS刺激组;（4）正常肠上皮细胞+LPS刺激组;（5）TLR4受体阻滞剂TAK242+LPS刺激组（LPS刺激浓度为10μg/ml）。十二小时后,对各组细胞的凋亡情况、TLR4受体表达水平和蛋白质含量,及对下游促炎因子IL-1β、TNF-a的表达水平和蛋白质含量用流式细胞分析仪、rt-qPCR、Western blot,及免疫酶联吸附实验（ELISA）检测,并进行组间的比较。结果:①经过Illumina二代测序分析,总共获得三条差异表达最明显的miRNA:miR-146a-5p、miR-145-5p 和 miR-222-3p。将 miR-145-5p 作为研究对象（原因在方法部分已说明）。经过三大miRNA数据库对其下游靶基因的预测,共获得77个相关靶基因。对其进行了 GO和KEGG通路富集的分析,发现它们主要富集于Rap信号通道、Wnt信号通道、紧密连接蛋白通道以及MAPK通道等,通过String网站,进行PPI蛋白互作网分析,并用Cytoscape软件对该网络进行分析,结果显示,在这77个基因中,TLR4在共表达得分中最高,且与炎症密切相关。②经过流式细胞检测,我们发现,OE+LPS组细胞存活率为96.5%,而vector+LPS组,inhibition+LPS组及正常细胞+LPS组的细胞存活率分别为:80.1%、81.7%及70.2%。经过rt-qPCR检验,与母乳喂养组小鼠比较,发现NEC组小鼠肠道组织中的miR-145-5p的表达明显下降,而TLR4的表达则明显上升（p＜0.05）。经过细胞水平验证,与空载组相比,miR-145-5p沉默（inhibition）+LPS刺激组和正常肠上皮细胞+LPS刺激组的TLR4受体表达及炎性因子水平相较miR-145-5p过表达（OE）+LPS刺激组明显上调（p＜0.05）,而miR-145-5p过表达（OE）+LPS组的TLR4表达水平则与空载对照组相似,而TAK242+LPS刺激组TLR4受体表达略微上调,而各炎性因子水平则明显下调,与miR-145-5p过表达+LPS组相似。结论:母乳源的外泌体miR-145-5p,可通过抑制TLR4受体表达而减少对其下游发炎性因子的表达,缓解肠道的炎症损伤,维护肠道上皮的完整性,从而对NEC的发生与发展发挥预防和治疗的作用。