论文部分内容阅读
运动发酵单胞菌ZM4（ZM4）因其高的醇产率和耐受力受到越来越多的关注，成为生物乙醇生产的候选菌株。运动发酵单胞菌ZM4基因组测序及全基因组模型发表，对运动发酵单胞菌的代谢网络、产醇策略等有了很大指导意义，特别是与主碳转运及代谢、产醇相关的基因受到了较多的关注。通过分析转录组，获得与基因转录水平有关的信息，可以揭示基因表达与一些生命现象之间的内在联系，加深对运动发酵单胞菌的认识，有利于进一步利用运动发酵单胞菌。结合RNA的反转录体系，实时定量PCR技术已成为对各种组织细胞进行转录研究的重要技术手段。而荧光定量标准化概念——MIQE的提出，将引导今后定量实验的规范性，确保实验结果的完整性、重现性和可靠性，促进实验室之间的一致性。目前Real-time qPCR技术在运动发酵单胞菌中的研究很少。本文主要目的是在ZM4中建立Real-time qPCR技术平台，并确定一套可靠的用于运动发酵单胞菌转录分析数据标准化的体系，包括内参基因的选择，对目的基因转录水平的检测及分析，确定在不同生长阶段ZM4主碳代谢途径基因转录水平的变化等，进而将该体系应用于不同碳源及糖浓度下主碳代谢途径基因转录水平变化分析。本文建立了ZM4总RNA提取及定量的方法体系和在ZM4中利用real-timeqPCR进行转录分析的详细方法。在内参基因的筛选中，利用real-time qPCR技术研究了18个候选内参基因在ZM4整个生长周期中的mRNA水平。利用geNorm、NormFinder和BestKeeper三个软件综合评价，筛选出7个相对稳定表达的候选内参基因，最终确定了ZMO0367，ZMO0487和ZMO1955作为内参基因进行数据标准化，分析ZM4不同生长阶段主碳代谢途径基因转录水平变化。以此确立了Real-time qPCR技术平台用于运动发酵单胞菌转录分析数据标准化的体系。在此基础上，本文分析了在RM培养基中分别添加2%葡萄糖，15%葡萄糖，20%葡萄糖，28.5%蔗糖和38%蔗糖5个培养条件下野生型ZM4及突变株ZM4(gfo::FRT)（插入缺失gfo基因）在对数中期、稳定期的26个样本中主碳代谢途径基因转录水平的差异性，并利用HLPC法分析了5个培养条件下两菌株代谢物水平的变化。筛选的7个内参基因在一定研究条件下有较好的稳定性。gfo基因的缺失对运动发酵单胞菌醇代谢基因转录水平有一定的影响，尤其在蔗糖发酵中较为明显。ZM4(gfo::FRT)菌株在蔗糖中醇产率较ZM4高，主要是由gfo基因的缺失使得其它基因转录水平及代谢流变化引起的。研究结果表明，不同实验条件下选择合适的内参基因对实验结果的可靠性非常重要。ZM4主碳代谢途径基因在不同生长阶段转录丰度与水平的变化并不一致，且有些基因的变化相当显著。运动发酵单胞菌的生理表现是转录水平与蛋白质水平共同作用的结果。